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引物和探針的設計是qPCR實驗中最開始環(huán)節(jié)。 桌面——Primer Premier，Primer Express(下載破解版） 在線——Prime3Plus（http:///cgi-bin/dev/primer3plus.cgi） QuantPrime（https://www./） Primer Blast（https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/index.cgi） 原則： 1、引物長度常用為18-27bp， 2、引物GC含量45-55%為宜。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近； 3、Tm值最好72℃左右。 4、引物3’端的堿基一般不用A。A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR反應失敗。 5、堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 6、 盡量在Exon junction上設計引物，限制基因組DNA擴增。 7、 使用BLAST檢索，確認引物特異性。
案列：以SARS-CoV-2的N基因，介紹引物和探針的設計。 進入NCBI官網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm./），選擇在“Nucleotide”數(shù)據(jù)庫中搜索“SARS-CoV-2”的核酸序列。 ? 可看到SARS-CoV-2的詳細信息，包括所有注釋的蛋白讀碼框，點擊條目進入。 ? 基因組序列信息展示在頁面最下面，可以將其復制粘貼到文本文檔中加以保存；點擊頁面右邊“Analyze this sequence”功能中的“Pick Primers”選項。 ? 可以看到在模板區(qū)域已經(jīng)顯示出SARS-CoV-2的Reference Sequence No.，另外的兩種上傳模板信息的方法是將完整序列粘貼過來或者上傳文本文檔。由于我們要在N基因（CDS區(qū)域從28274到29533）上設計引物探針，因此需要在右邊規(guī)定上下游引物的起始終止范圍。
? 引物參數(shù)設置。如有固定的上游或者下游引物而只需搜索另外一條，可以將序列填到相應的位置。PCR產(chǎn)物范圍設定為70 bp-150 bp，Tm最佳設為59℃，最高不超過61℃，上下游引物Tm最多差2℃，稍微將范圍縮小可以幫我們找到質(zhì)量更好的引物。修改過的參數(shù)以黃色框標注，另外PrimerBlast還有個好處是不懂的參數(shù)意義可以直接點開旁邊的問號標識打開提示。 ? 外顯子/內(nèi)含子選擇。這一部分對于設計用于真核生物的基因表達的引物很重要，可以設計跨外顯子的引物用于排除genomic DNA的干擾?！癊xon junction span”處選擇“引物必須跨外顯子設計”，“Exonjunction match”設定外顯子接合處兩端與引物匹配最少的堿基數(shù)量，一般5'端要比3'端要多，因為3'的匹配對于啟始PCR非常關(guān)鍵，因此無需太多的匹配堿基來保證這一點，默認參數(shù)基本可以滿足?！癐ntron inclusion”是以genomic DNA為模板時保證PCR反應要跨越至少一個內(nèi)含子，從而可以輕易區(qū)分其與以cDNA為模板時的產(chǎn)物（長度不同）。是否要激活該選項取決于具體實驗，因為既要保證產(chǎn)物小于150bp，還要保證一條引物跨外顯子，并且引物被內(nèi)含子分隔開，這顯然不可能。因為沒有一個外顯子區(qū)段是小于150 bp的，所以一般該選項不會用于qPCR實驗引物的篩選。由于我們要篩選檢測病毒的引物，所以這些選項都不需要更改。 ? 引物特異性檢查。在提取SARS-CoV-2核酸的同時，不可避免會把人細胞的RNA一起提取純化，因此需要避免引物在人的RNA中發(fā)生錯配擴增導致假陽性。數(shù)據(jù)庫選擇“Refseq RNA”，物種選擇人。在嚴格程度部分，圖示中表示的意思是，引物在錯配時至少要有4個堿基是不匹配的，其中在3’端最后的5個堿基中至少要有3個是不匹配的。另外當靶標與引物的錯配堿基大于等于6時就排除該靶標（意味著不太可能產(chǎn)生錯配的產(chǎn)物）。這些參數(shù)的設置都是要在嚴格程度和篩選難易程度上做平衡。 ? 點開“Advancedparameters”選項卡，在“Primer parameter”中做如圖示的改動，其他參數(shù)保持默認。這些參數(shù)的意義不在此一一詳述，但絕大部分的默認參數(shù)都可以保證較高的引物質(zhì)量。 ? 雜交探針的設計。如圖所示設置探針大小、Tm值等參數(shù)，同時勾選“Pick internal hybridizationoligo”和下面的“Show results in a new window”(便于后期修改參數(shù)再次進行篩選)，點擊“GetPrimers”。 ? 圖形化展示。首先給出引物對在模板中的相對位置，點擊每一對引物可以獲得具體的信息。 ? 引物和探針信息。結(jié)果頁面下面給出了十對引物和相應探針的詳細信息，包括序列、Tm和GC含量等。Selfcomplementarity和Self 3' complementarity數(shù)值越小越好，表明發(fā)生引物二聚體或者自身配對的概率很低。下圖展示了前三對質(zhì)量均較高的引物，一般而言探針離著上游引物越近剪切效率越高，但要保持3bp以上，所以第二對引物是不太合適的，第一對和第三對都可以選擇（事實上兩者相似度很高）。另外要注意的是探針5’端不能是G堿基開頭，所以要把第一個堿基刪掉。 至此，N基因的引物探針就設計完了，但檢測SARS-CoV-2的準備工作還沒有結(jié)束。對于高度危險的SARS-CoV-2而言，單靶點的檢測是不夠的，需要用兩個甚至三個靶點同時檢測來提高檢出率，所以目前市場上的試劑盒基本都是兩重（ORF1ab，N）或者三重（ORF1ab，N和E）。另外，SARS-CoV-2與SARS-CoV的序列相似度高達79%[4]，因此需要避免對SARS-CoV的誤檢，所以要盡可能在相似度最低的區(qū)域來設計引物探針（如下圖所示）。
最后，關(guān)于引物探針設計的一些小Tips： I. 一般而言，引物探針設計完后最好再次進行specificity的確認，尤其是三重qPCR的引物探針是要混到一起的，有可能發(fā)生引物或者探針之間的交叉反應； II. 搜索引物探針時條件可適當放寬，畢竟在qPCR反應中發(fā)生非特異性擴增需要同時滿足三個條件：上下游引物和探針都可以比較“牢固”的匹配錯誤位點，這也正是探針法相對染料法特異性更高的原因。 III. 對于同一個區(qū)段用不同工具設計出來的引物探針序列未必相同，但并不代表有的質(zhì)量差。比如這次針對SARS-CoV-2的ORF1ab設計的引物探針，中國CDC和美國CDC給出的序列就都不一樣。事實上能夠滿足qPCR實驗要求的引物和探針組合是很多的，所以設計時我們不必執(zhí)著于質(zhì)量最高的那個組合。 IV. 無論設計工具的算法有多先進，探針引物的性能如何最終還是要靠實驗數(shù)據(jù)說話的。是否有非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生需要用PCR后跑膠的方式或者溶解曲線（更推薦）來確認，設定的最佳Tm也是要通過溫度梯度實驗來最終確認。設計工具給出的參數(shù)僅僅是參考，絕不能代替后續(xù)確認流程。從經(jīng)濟的角度考慮，一般推薦針對一個靶點設計一條探針和相應的三對引物，經(jīng)過實驗篩選后確定最佳的引物組合。
下一期我們將討論qPCR中兩大實驗類型——絕對定量和相對定量，一個很多人都容易犯迷糊的地方。 |
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