前言

很多研究僧在詢問如何查詢基因序列、如何進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、如何使用BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)……，這些問題在 NCBI 上都可以方便的找到答案。

交流經(jīng)驗(yàn)的時(shí)間到啦！

接下來本文將按以下幾個(gè)部分說一下 NCBI 的使用：

Part 1：如何查找基因序列、mRNA、Promoter

Part 2：如何查找連續(xù)的 mRNA、cDNA、蛋白序列

Part 3: 運(yùn)用 STS 查找已經(jīng)公布的引物序列

Part 4:如何運(yùn)用 BLAST進(jìn)行序列比對(duì)、檢驗(yàn)引物特異性

1、利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、啟動(dòng)子（Promoter）

下面以人的 IL6（白細(xì)胞介素 6）為例講述一下具體的操作步驟

1． 打開Map viewer 頁面， 網(wǎng)址為： http://www.ncbi.nlm./mapview/index.html 在 search 的下拉菜單里選擇物種，for 后面填寫你的目的基因。操作完畢如圖所示：

2．點(diǎn)擊“GO”出現(xiàn)如下頁面：

3． 在步驟二圖示的右下角有一個(gè)Quick Filter,下面是讓你選擇的幾個(gè)復(fù)選框， 在Gene前面的小方框里打勾，然后點(diǎn)擊Filter. 出現(xiàn)下圖：

說明一下：1、染色體的紅色區(qū)域即為你的目的基因所處位置。2、下面參考序列給出了三個(gè)，是不同的部門做出來的，經(jīng)我驗(yàn)證，序列有微小的差異，但總體來說基本相同。盡管你分別點(diǎn)擊后，序列代碼、序列代碼等有所差異，但堿基基本一致，不影響大家研究分析序列?，F(xiàn)在普遍采用的是最上面的那個(gè)序列，這一條是世界范圍的生物科學(xué)家用計(jì)算機(jī)合成的一個(gè)序列。我也推薦大家使用這個(gè)序列。

4．點(diǎn)擊上述三條序列第一條序列（即 reference）對(duì)應(yīng)的'Genes seq'，出現(xiàn)新的頁面，頁面下方為：

5．點(diǎn)擊上圖出現(xiàn)的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下載查看序列等功能，結(jié)果如圖所示：

先對(duì)上面這張圖做點(diǎn)簡要的說明，在 Sequence Format（序列輸出格式）后面是一個(gè)下拉式選擇菜單，默認(rèn)的為 FASTA 格式，還有一個(gè)是 GenBank 格式。我推薦大家選擇 GenBnak格式，因?yàn)檫@個(gè)格式提供了很多該基因的信息，而 FASTA格式只有基因序列。

6．在 Sequence Format 后選擇 GenBank，然后點(diǎn)擊下面的 Display，目的基因的相關(guān)信息和序列就出現(xiàn)在眼前了。點(diǎn)擊后如圖所示（網(wǎng)頁較大，只抓取一小部分以作示范） ：

在上述打開的網(wǎng)頁中，你可以看到基因長度，基因序列，以及這個(gè)基因是如何被報(bào)道出來的等各種信息。 你會(huì)看到:  mRNA  join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..8394) 這代表了從基因的 3598位開始就是轉(zhuǎn)錄區(qū)了， 即我們常說的 mRNA 片斷， 由于內(nèi)含子的存在，所以 mRNA 在DNA 序列上分成了幾段。 CDS join(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057, 7803..7970) CDS 代表編碼序列，即蛋白編碼區(qū)是從 3660 開始的（ATG） ，由于剪接作用所以 CDS 區(qū)也是不連續(xù)的。

說到這里，可能很多朋友都已經(jīng)明白了 promoter 即啟動(dòng)子區(qū)域在哪里了。但我還是再嘮叨幾句：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前面是基因的調(diào)控區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)沒有明顯的位置定義，大家也只是猜測它的大體位置，如果你要研究 promoter 區(qū)的話，建議你選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的 2000個(gè)堿基進(jìn)行研究，一般默認(rèn)的是這樣。當(dāng)然你如果覺得長度太長不好研究的話，也可以只研究-1000 到0這一千個(gè)堿基，因?yàn)橐话闱闆r下，啟動(dòng)子區(qū)的變異都在這個(gè)區(qū)域內(nèi)。

這樣大家就可以找到自己的目的基因序列和啟動(dòng)子了，這種方法可能使用的人不是很多，但我個(gè)人比較喜歡，因?yàn)樗畲蟮膬?yōu)點(diǎn)是可以找到啟動(dòng)子區(qū)域和其他調(diào)控區(qū)域。希望大家可以發(fā)帖交流，讓我們把 NCBI 用的更好！

2、如何查找連續(xù)的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人類的 IL6 為例）

1．進(jìn)入NCBI 主頁：http://www.ncbi.nlm./ 在 search 后面選擇 Gene，在 for 后面填寫需要查找的基因的名字。如圖所示：

出現(xiàn)了很多基因序列，在每個(gè)序列的右邊還有“Order cDNA clone” 的鏈接，這些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是別名（Other Aliases）與你的目的基因一致，根據(jù)每個(gè)序列的介紹認(rèn)真選擇你的目的基因。上圖中我需要的 IL6 是標(biāo)號(hào)為2的序列。

2.1 查找 cDNA 序列

2.1.1  點(diǎn)擊Order cDNA clone, 出現(xiàn)目的頁面如圖所示：

2.1.2  點(diǎn)擊Clone Sequence 后面的鏈接即可得到cDNA 序列。點(diǎn)擊后如圖所示（只抓取其中一部分）

2.2  查找 mRNA、蛋白序列

回到步驟 1 點(diǎn)擊“Go”之后出現(xiàn)的頁面，點(diǎn)擊目的基因的名字，出現(xiàn)以下頁面 (只抓取相關(guān)部分)：

頁面的下半部分，即可以獲取 mRNA和蛋白序列的部分：

找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分為幾個(gè)板塊，第一個(gè)“mRNA and Protein ”區(qū)可以讓我們找到連續(xù)的編碼 mRNA 序列和蛋白序列。在 mRNA and Protein下面有兩個(gè)序列代碼（中間劃有一個(gè)箭頭） ，這代表了 mRNA序列和蛋白序列。分別點(diǎn)擊就可以得到相應(yīng)的序列頁面。點(diǎn)擊后如圖所示，mRNA 序列：

NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二個(gè)板塊是 Reference assembly，它下面顯示的是 Genomic ，點(diǎn)擊 Genomic 下面Reference assembly 對(duì)應(yīng)的 Genbank 或 FASTA 即可出現(xiàn)編碼的 DNA 序列（注意：只是編碼序列，其中包括內(nèi)含子，但一般沒有 5‘非編碼區(qū)） 。一步就不做貼圖演示了吧，

這樣我們就可以找到基因的 cDNA 序列、連續(xù)的編碼 mRNA 序列、蛋白序列以及含有內(nèi)含子的編碼DNA 序列了。相信這些操作對(duì)很多戰(zhàn)友還是有用的。

友情提示：在 NCBI 里打開的每一個(gè)頁面都會(huì)給我們提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能會(huì)有令我們驚喜的收獲！

3、運(yùn)用STS 查找已經(jīng)公布的引物序列

STS，序列標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequence Tagged Site）：一段短的DNA 序列（200－500 個(gè)堿基對(duì)），這種序列在染色體上只出現(xiàn)一次，其位置和堿基順序都是已知的。在PCR 反應(yīng)中可以檢測處STS 來，STS 適宜于作為人類基因組的一種地標(biāo)，據(jù)此可以判定DNA 的方向和特定序列的相對(duì)位置。以上內(nèi)容基本是STS 的定義，要活學(xué)活用，下面就介紹一下用STS 數(shù)據(jù)庫查找引物的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)。

還是使用人的IL6 基因?yàn)槔?/span>

1． 打開 NCBI 主頁，在 Search 后面的下拉菜單選擇 UniSTS，在 FOR 后面填寫目的基因。

操作完畢如圖所示

點(diǎn)擊GO以后出現(xiàn)以下頁面

這是你會(huì)發(fā)現(xiàn) NCBI 又提供了很多序列，下面我們還是要初步篩選我們需要的序列。

2．根據(jù)物種、目的引物所在染色體的位置等選擇相應(yīng)序列（可能不只一個(gè)） ，點(diǎn)擊。 下面以點(diǎn)擊第一個(gè)進(jìn)入的畫面為例。  

你會(huì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)頁面直接就給出了引物序列，PCR之后的片段長度也是給了的（247bp） 。下面還有很多相關(guān)的信息……

3．點(diǎn)擊GeneBank Accession 后面的代碼，進(jìn)入下一個(gè)頁面。

前后引物都呈現(xiàn)在眼前了，還有反應(yīng)體系和反應(yīng)條件！其中 Primer A 是前引物序列，Primer B 則是后引物序列，并且給出了他們?cè)?/span> DNA 序列中的位置。有興趣的朋友可以在序列中找一下，是可以找到的， 不過要注意，PCR 是雙鏈擴(kuò)增，在序列中可以直接找到的是 Primer A 的原序列 和 Primer B的互補(bǔ)序列。

在步驟二里面我只點(diǎn)開了一個(gè)序列，繼續(xù)打開其他的可能還會(huì)有對(duì)自己有用的引物，不過這要你自己慢慢發(fā)掘了。

這種尋找引物的方法有點(diǎn)投機(jī)取巧的味道，實(shí)用程度不是很高，但如果這里面恰好有你想 P 的片段的話，恭喜你，這些引物都是很成熟的引物，可以直接拿過來使用了。

如果這兩種方法都不能找到你需要的引物的話， 那就自己設(shè)計(jì)吧， 建議使用 Primer 5 和 Oligo。

4、如何運(yùn)用 BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)、檢驗(yàn)引物特異性

提到序列比對(duì)，絕大多數(shù)戰(zhàn)友都會(huì)想到 BLAST，但 BLAST 的使用確實(shí)又是一個(gè)很大的難題， 因?yàn)樗墓δ鼙容^強(qiáng)悍， 里面涉及到的知識(shí)比較多， 而且比對(duì)結(jié)束后輸出的結(jié)果參數(shù) （指標(biāo)）又很多。如果把 BLAST 的使用詳細(xì)的都講出來，我想我發(fā)帖發(fā)到明天也發(fā)不完，更何況我自己也不是完全懂得 BLAST 的使用。 所以我在這里也就“畫龍點(diǎn)睛”——以比對(duì)核酸序列為例來給大家介紹一下 BLAST 的使用， 也算是 BLAST 的入門課程吧。 請(qǐng)看帖的戰(zhàn)友好好體會(huì)，如果你用心看，在看帖完畢之后 BLAST 的基本使用（包括其他序列的比對(duì)）應(yīng)該沒有問題了。

1．打開BLAST 頁面，http://www.ncbi.nlm./BLAST/ 打開后如圖所示：

對(duì)上面這個(gè)頁面進(jìn)行一下必要的介紹：

BLAST 的這個(gè)頁面主體部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂這三個(gè)短語的意思，我就不多說了；我要說的是，可以認(rèn)為這是三種序列比對(duì)的方法，或者說是 BLAST 的三條途徑。

第一部分 BLAST Assembled Genomes 就是讓你選擇你要比對(duì)的物種，點(diǎn)擊相應(yīng)物種之后即可進(jìn)入比對(duì)頁面。

第二部分 Basic BLAST 包含了 5 個(gè)常用的 BLAST，每一個(gè)都附有簡短的介紹。

第三部分 Specialized BLAST 是一些特殊目的的 BLAST，如 IgBLAST、SNP 等等，這個(gè)時(shí)候你就需要在 Specialized BLAST部分做出適當(dāng)?shù)倪x擇了。

總之， 這是一個(gè)導(dǎo)航頁面， 它的目的是讓你根據(jù)自己的比對(duì)目的選擇相應(yīng)的 BLAST 途徑。

下面以最基本的核酸序列比對(duì)來談一下 BLAST的使用， 期間也會(huì)捎帶著說一下其他序列比對(duì)的方法。

2． 點(diǎn)擊Basic BLAST部分的nucleotide blast 鏈接到一個(gè)新的頁面。打開后如圖所示：

介紹一下上述頁面：

Enter Query Sequence 部分是讓我們輸入序列的，你可以直接把序列粘貼進(jìn)去，也可以上傳序列，還可以選擇你要比對(duì)的序列的范圍（留空就代表要比對(duì)你要輸入的整個(gè)序列） 。Job Title 部分還可以為本次工作命一個(gè)名字。

Choose Search Set 部分是讓我們選擇要與目的序列比對(duì)的物種或序列種類（genome DNA、mRNA 等等） 。如果是人或老鼠的話，就可以直接選擇了如果是其他物種就要選擇“others”了，這時(shí)候網(wǎng)頁會(huì)主動(dòng)跳出一個(gè)下拉對(duì)話框和一個(gè)輸入式對(duì)話框，你可以分別選擇和輸入要跟你的序列比對(duì)的序列種類和物種。下面的 Entrez Query 可以對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)南拗啤?/span>

Program Selection 部分其實(shí)是讓我們選擇本次比對(duì)的精確度，種內(nèi)種間等等。

在 BLAST 按鈕下面有一個(gè)“Algorithm parameters” ，這是參數(shù)設(shè)置選項(xiàng)，一般用戶使用不到此項(xiàng)，所以它比較隱蔽，點(diǎn)擊，原網(wǎng)頁下方即可增加了 Algorithm parameters 的內(nèi)容。大部分戰(zhàn)友都用不到更改這里面的選項(xiàng)，我也不多說了，有興趣的朋友可以自己研究一下。

3．依次填寫上述網(wǎng)頁必須部分，點(diǎn)擊 BLAST 按鈕后，出現(xiàn)如下界面（只截取其中一部分） ：

出現(xiàn)的這個(gè)結(jié)果頁面信息含量非常大，如果我們用心觀察，還是可以發(fā)現(xiàn)其中的一些主要指標(biāo)的。列舉上圖也是為了給大家展示一下這些評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。其中 Description 部分推薦大家詳細(xì)看一下，另外說一下“E value” 這個(gè)指標(biāo)與其他指標(biāo)不同，它的數(shù)值越小相似程度越高，其他幾個(gè)（如 Totle score）都是數(shù)值越高相似度越高。

在這個(gè)圖示的表格下方就是具體的相似性的核酸序列了，還配合著各種參數(shù)的得分。