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一般來說，獲取引物的方式有5種： 1），查詢相關(guān)文獻(xiàn)（建議參考IF≥5的文獻(xiàn)）； 2），引物合成公司在線設(shè)計(jì)（如： 金斯瑞，http://www./DNA_Oligo.html?src=mostpopular； 生工，https://www./newPrimerDesign（需注冊并登錄））； 3），Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件； 4），引物數(shù)據(jù)庫（如Primerbank，https://pga.mgh./primerbank/）； 5），NCBI在線設(shè)計(jì)。 利用文獻(xiàn)檢索引物或引物合成公司在線設(shè)計(jì)都無法保證引物的特異性，引物數(shù)據(jù)庫則有時(shí)無法找到所需物種對應(yīng)的引物，而設(shè)計(jì)軟件又存在諸多規(guī)則，短時(shí)間內(nèi)難以掌握，而NCBI在線設(shè)計(jì)引物則可避免以上遺憾，成為科研道路上的有力助益。
1、檢索目的基因序列 打開NCBI官網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm./），將搜索數(shù)據(jù)庫改為“Gene”，在搜索欄輸入目的基因及種屬； 打開目的基因鏈接（注意鏈接后面有關(guān)該基因的描述，不要選錯(cuò)物種來源了哦） 在新打開的頁面中找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，選擇“NM_******”打開鏈接 在新打開的頁面中找到目的基因序列，復(fù)制（記得是全部序列哦）； 2、利用數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物 打開NCBI官網(wǎng)，在頁面最下方找到“Primer-BLAST”，打開鏈接； 將目的基因序列粘貼在頁面左上的框框里； 在“Primer Parameters”條目下將“PCR product size”修改為Min=100，Max=300（熒光定量PCR法的有效擴(kuò)增范圍為70~350 bp，若要擴(kuò)增更大的目的基因片段需增加延伸時(shí)間）； 在該條目下找到“Primer melting temperatures（Tm）”設(shè)置所需引物的退火溫度（一般設(shè)置為55℃~63℃） 在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”條目下 將“Organism”后默認(rèn)的人源種屬更改為目的基因來源種屬； 單擊頁面下方“Get Primers”，先去找靜靜聊聊，再回來看結(jié)果（一般需等待3~5 min網(wǎng)站才能反聵設(shè)計(jì)結(jié)果） 3、選擇合適的引物 網(wǎng)站一般會反聵10條引物供選擇，篩選滿足下列條件的引物： 1），連續(xù)相同的堿基≤3個(gè)； 2），GC所占比例在40%~60%之間； 3），引物自身或兩條引物間不能有連續(xù)4個(gè)堿基互補(bǔ)； 4），引物長度在15~30個(gè)堿基之間； 5），引物3’端盡量不要以“A”結(jié)尾，但也應(yīng)避免連續(xù)3個(gè)“G”或“C”。 4、初步驗(yàn)證引物特異性 （由于頁面顯示原因，在設(shè)計(jì)結(jié)果頁面上給出的擴(kuò)增結(jié)果有時(shí)并不是全部的可能擴(kuò)增結(jié)果，因而需利用Primer-BLAST再次驗(yàn)證） 打開“Primer-BLAST”頁面，在“Primer Parameters”條目下的兩個(gè)框框里分別輸入選定引物的正向序列和逆向序列， 在下方修改引物所擴(kuò)增基因的種屬，“Get Primers”，等待數(shù)據(jù)庫測試結(jié)果。 若反聵頁面的“Products on target templates”中存在70~350 bp之間的非目的基因片段，則該引物可能存在非特異性擴(kuò)增，該引物不可用；若擴(kuò)增出非目的基因片段＞350 bp，則該引物可能不存在非特異性擴(kuò)增，引物可用，但以非目的基因片段＞500 bp為妥。 若存在“transcript variant X*”一類產(chǎn)物，是目的基因在轉(zhuǎn)錄后的不同剪切體，一般不影響引物特異性，該引物可用。 基金、課題設(shè)計(jì)、科研輔導(dǎo)群 備注：入群學(xué)習(xí) 從以下20個(gè)熱點(diǎn)入手，每天給大家分享干貨：
而這些研究方向參與疾病發(fā)生發(fā)展過程的分子機(jī)制，可以歸納總結(jié)為一下幾類研究： ①分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、小分子）的表觀遺傳修飾； ②分子拷貝數(shù)的表達(dá)變化差異； ③RNA分子的剪接加工、出核、細(xì)胞組織水平的時(shí)空變化研究； ④特殊的一群細(xì)胞類型研究、細(xì)胞通訊微環(huán)境研究； ⑤具有臨床應(yīng)用潛力的新技術(shù)（CRIPSR）或者載體（膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞等）； ⑥關(guān)注細(xì)胞生理學(xué)現(xiàn)象：自噬、凋亡、線粒體失功等； |
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