|
想做10x單細(xì)胞測(cè)序，需要制備合格的細(xì)胞懸液
來來來，跟著大閱哥走，問題全解決。 如果您對(duì)您的樣本非常了解， 那也不要忘了看看最后的注意事項(xiàng)哦。 如何制備單細(xì)胞測(cè)序細(xì)胞懸液？ 對(duì)于細(xì)胞懸液制備沒有經(jīng)驗(yàn)，那就請(qǐng)按照以下的五步走啦： ★ 第一步 從官網(wǎng)查看10x Genomics單細(xì)胞懸液制備官方建議 第二步 利用關(guān)鍵詞查詢與自己樣本類型相同的已發(fā)表的單細(xì)胞測(cè)序文獻(xiàn) 第三步 參考知名protocol分享網(wǎng)站，選擇適合自己的protocol 第四步 選用單細(xì)胞懸液制備或細(xì)胞分選的商業(yè)試劑盒 第五步 參考懸液制備和質(zhì)控中的注意事項(xiàng) 下面，讓我們?cè)敿?xì)看看每個(gè)步驟吧。 第一步【10x Genomics單細(xì)胞懸液制備官方建議】 首先，10x Genomics官網(wǎng)上已有制備部分樣本單細(xì)胞懸液的官方建議，每個(gè)建議都有相關(guān)案例解析。當(dāng)您需要制備單細(xì)胞懸液時(shí)，第一步當(dāng)然是先查看官方建議中是否有和自己要處理的樣本一樣的protocol，如果有的話，就可以直接拿來用，閱微基因已經(jīng)幫您翻譯整理了官方給出的12個(gè)建議，歡迎索取~ 10x Genomics單細(xì)胞官方建議 
閱微基因根據(jù)10x官方建議 總結(jié)出的單細(xì)胞懸液樣本制備建議  快快聯(lián)系我們吧 詳詢4000-192-196 如果官方建議中沒有適合的參考方案， 那咱們就看第二步！ 第二步【相關(guān)單細(xì)胞測(cè)序文獻(xiàn)報(bào)道】 當(dāng)我們遺憾地發(fā)現(xiàn)在官方建議中沒有適合自己細(xì)胞懸液制備的protocol時(shí)，就需要走到第二步啦?，F(xiàn)如今已發(fā)表的使用10x單細(xì)胞技術(shù)的文章已經(jīng)有很多了，且大部分影響因子較高。針對(duì)人類和小鼠的大部分組織樣本基本上已有相關(guān)文獻(xiàn)，其中甚至有一些研究專注于組織解離條件優(yōu)化。所以我們可以上網(wǎng)搜搜和自己相同樣本類型的文獻(xiàn)，參考其解離方法及高分文章的研究思路。 閱微基因貼心的幫您總結(jié)好了超150篇最新最全的10x單細(xì)胞測(cè)序發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，并按照研究方向歸類，快向我們索要吧（詳詢4000-192-196）。 閱微基因總結(jié)的部分文章（參考文獻(xiàn)請(qǐng)查看文末） 其中，2018年發(fā)表于《Nature Protocols》的文章“Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies”提供了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的常規(guī)研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南。讓我們先來看看這篇文章在樣本處理和單細(xì)胞懸液制備上給出了哪些建議。
首先，建議采用無菌樣品處理方式，包括使用不含核酸酶的試劑和耗材。 2 為減少對(duì)細(xì)胞的損傷，移液和離心應(yīng)保持在最低程度。在給定的離心速度、時(shí)間和溫度下，細(xì)胞濃度和大小直接影響制備的效率。緊密堆積的細(xì)胞沉淀可能需要額外的操作，但可能也因此會(huì)通過剪切效應(yīng)損害細(xì)胞。當(dāng)然，在這個(gè)時(shí)候就需要調(diào)整離心條件。 3 此外，在進(jìn)行細(xì)胞清洗和重懸過程中，使用具有足夠容積的器皿也可避免高濃度導(dǎo)致細(xì)胞集聚和結(jié)塊。
實(shí)體組織需要在一開始進(jìn)行機(jī)械分離或酶消化處理。首先，組織需要通過物理切割或刀片切碎，然后通過酶消化來分離細(xì)胞。特定的組織消化酶及消化時(shí)間需要仔細(xì)選擇。 2 樣本準(zhǔn)備過程可能會(huì)引起細(xì)胞中基因表達(dá)模式的改變，特別是一些脅迫相關(guān)基因的激活。此外，一些敏感的細(xì)胞亞型可能在此過程中受到傷害。所以，樣本準(zhǔn)備過程越短越好。相反，如果消化時(shí)間太短，可能導(dǎo)致細(xì)胞分離不完全，需要在后續(xù)單細(xì)胞分析過程中排除掉這些緊密相連的細(xì)胞。 3 在細(xì)胞解離的過程中加入DNase I可以防止細(xì)胞團(tuán)塊的形成。 第三步【參考知名protocol網(wǎng)站中的方法】 查找文獻(xiàn)難度大，選擇文章決定難？ 找不到適合自己組織樣本解離的相似文章？ 不要急，我們接下來走到第三步。國外有很多專門供大家查看protocol的網(wǎng)站，上面有大量關(guān)于不同組織解離成單細(xì)胞懸液的資料。很多都是直接鏈接到相關(guān)文章，其中的protocol也已經(jīng)被提取好呈現(xiàn)出來了，簡(jiǎn)直不要太爽。 例如，大閱哥在知名的protocol分享網(wǎng)站“protocol.io”上以“tumor tissue dissociation single cell”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，有高達(dá)579條的結(jié)果呈現(xiàn)。老師們快去探寶吧！當(dāng)然，“CSH protocols”是冷泉港實(shí)驗(yàn)室分享protocol的網(wǎng)站，內(nèi)容也非常豐富哦。 網(wǎng)站：http://www./ 網(wǎng)站：http://cshprotocols./ 第四步【商業(yè)試劑盒選擇與官網(wǎng)上建議】 找到了protocol，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)優(yōu)化。當(dāng)然，酶在組織消化當(dāng)中是非常重要的試劑。不同組織類型選擇什么樣的酶呢？可以去Worthington的官網(wǎng)查看不同組織所用酶表，提供了高達(dá)30余種不同組織樣本最適酶的方案。
同時(shí)，上面提到的Nature Protocol[13]的文章中也有提到不同樣本最適酶的選擇。 不想去找protocols，或者找到了protocol，里面的一些試劑和組分還需要現(xiàn)買，太麻煩。 有沒有專門的試劑盒來進(jìn)行組織消解呢？ 當(dāng)然是有的啦。 首選10x Genomics官方推薦的試劑盒品牌“Miltenyi 美天旎”，他家有多款商業(yè)試劑盒，可以進(jìn)行組織解離和細(xì)胞分選。 閱微基因總結(jié)美天旎組織消解試劑盒名稱與規(guī)格 第五步【注意事項(xiàng)】 相信通過前四個(gè)步驟，我們一定能夠成功地找到適合自己樣本的單細(xì)胞懸液制備方法。但是我們的五步法還沒有結(jié)束哦，還有最后一步，這一步就是通用的注意事項(xiàng)。這些經(jīng)驗(yàn)是閱微基因在處理不同樣本時(shí)積累下來的經(jīng)驗(yàn)，大家一定不能錯(cuò)過，快快拿出小本本進(jìn)行記錄吧。
在拿到一個(gè)心儀的protocol后，如果在這之前沒有對(duì)自己的細(xì)胞解離過，那么一定要先進(jìn)行一下預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到一個(gè)真正適合樣本、能夠達(dá)到建庫標(biāo)準(zhǔn)的protocol。在進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，需要考慮到的因素包括樣本組織類型、樣本來源、是否進(jìn)行過基因編輯、解離時(shí)使用的培養(yǎng)基、選用何種酶、酶的濃度、解離時(shí)候的溫度和解離時(shí)間等。這些都需要提前確認(rèn)好，這樣才能在真正建庫時(shí)有十分的把握。 2 新鮮的組織最好可以立即解離，比如剛剛下手術(shù)的組織。如果太長(zhǎng)時(shí)間沒有解離完成的話，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)死亡，進(jìn)而大大降低細(xì)胞活性，影響建庫效率。如果需要對(duì)組織進(jìn)行保存的話，我們建議將拿到的組織立即放進(jìn)組織保存液當(dāng)中，然后放到4℃保存。從拿到組織到最終解離完成，最好不要超過36小時(shí)。 3 根據(jù)細(xì)胞直徑大小的不同，需要離心的時(shí)間和速度也是不同的。一般來說，直徑較大的細(xì)胞選用室溫150rcf離心3min，直徑較小的選用300rcf離心5min。 4 最好可以使用寬槍頭重懸，從而減少細(xì)胞損傷。窄槍頭劇烈的重懸會(huì)顯著影響細(xì)胞活性，同時(shí)讓細(xì)胞破裂，釋放RNA。釋放的RNA在Illumina上機(jī)擴(kuò)增放大時(shí)會(huì)影響數(shù)據(jù)。 5 建議使用含有0.04% BSA (bovine serum albumin)(400 μg/ml)的 1x PBS 溶液 (無 Ca2+、Mg2+) 重懸細(xì)胞。BSA的作用是防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)，若細(xì)胞結(jié)團(tuán)可適當(dāng)提升BSA濃度，但最高不超過2%。 6 原代細(xì)胞和干細(xì)胞這種比較敏感的細(xì)胞類型可能需要額外的溶液或培養(yǎng)基。已確定以下溶液對(duì)人 293T/17和小鼠 NIH/3T3細(xì)胞系的10x單細(xì)胞操作無影響：
如果在上述溶液中不能維持細(xì)胞活力，可以用常見的細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌重懸細(xì)胞。以下培養(yǎng)基已確定對(duì)人293T/17和小鼠NIH/3T3細(xì)胞系的10x單細(xì)胞操作無影響：
7 細(xì)胞計(jì)數(shù)需要設(shè)置2個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)2次，共計(jì)數(shù)4次。第一次懸液混勻后計(jì)數(shù)，第二次是再混勻后再計(jì)數(shù)。 8 另一個(gè)需要考慮的因素是不同類型的細(xì)胞在RNA含量上相距甚遠(yuǎn)，而準(zhǔn)確測(cè)定此參數(shù)將影響一些關(guān)鍵決定，比如文庫制備過程中的PCR循環(huán)數(shù)。舉個(gè)例子，人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的RNA含量極低，只有0.75 pg/細(xì)胞，而HCC38細(xì)胞系則富含RNA，含量達(dá)到21.6 pg/細(xì)胞。
制備懸液時(shí)間最好不超過4h。 2 單細(xì)胞的懸液中不能含有Ca2+和Mg2+，且不能含有諸如Tween 80之類的表面活性劑，否則會(huì)影響細(xì)胞活性。 3 視情況選擇合適尺寸的細(xì)胞篩。細(xì)胞尺寸可選20~40μm不等，，目的是濾掉雜質(zhì)和細(xì)胞團(tuán)。 4 推薦細(xì)胞活率為90%以上，低于80%不能上機(jī)。 5 細(xì)胞懸液的最適濃度：700~1200cells/μL。濃度過高，上樣體積太小，誤差太大；濃度太低，體積太大，會(huì)帶入一些雜質(zhì)和細(xì)胞團(tuán)等。 6 細(xì)胞懸液制備完成后要盡快建庫，樣本制備好到上機(jī)的時(shí)間間隔不宜超30min。不能保證同時(shí)制備多個(gè)樣本的細(xì)胞懸液時(shí)，可能導(dǎo)致各樣本之間懸液制備間隔時(shí)間過長(zhǎng)，此時(shí)則不建議一次完成多樣本建庫。 7 最佳上樣體積為2.5~15μL，建議上樣前根據(jù)需要上樣的細(xì)胞數(shù)調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度。 以上呢，就是閱微基因提供給您的完整的5步法制備合格的單細(xì)胞懸液。當(dāng)然了，所有的方法都需要您根據(jù)自己的樣本類型進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，切記照搬有風(fēng)險(xiǎn)，使用要謹(jǐn)慎，預(yù)實(shí)驗(yàn)非常有必要！ 彩蛋第六步【閱微基因直接來幫您】 實(shí)驗(yàn)室不具備解離組織的條件？實(shí)在沒有精力和時(shí)間去尋找合適的Protocol？預(yù)實(shí)驗(yàn)總是不成功？別擔(dān)心，彩蛋第六步——閱微基因幫您直接進(jìn)行樣本解離。請(qǐng)參考下圖選擇閱微基因的服務(wù)吧！ |
|
|
