|
對核酸分子（如DNA或RNA）進行測序，可以得到有關(guān)其核苷酸（腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤）順序的信息，這些核苷酸提供了生命所需的遺傳指令。 測序技術(shù)的發(fā)展源于Walter Fiers、Frederick Sanger和Ray Wu在1970年代的開創(chuàng)性工作[1]。在幾十年間，最初用于核酸測序的方法和技術(shù)經(jīng)歷了一個迅猛的發(fā)展：從讀取單個RNA分子開始，對整個生物體的基因組進行測序成為可能[2]。 第一個人類基因組草案于2001年在人類基因組計劃內(nèi)公布[3]，并與兩年后完成。 商業(yè)DNA測序儀首次生產(chǎn)于20世紀(jì)90年代末，它們被命名為下一代或第二代測序儀，以區(qū)別于第一批實驗性測序儀，并允許對整個基因組進行測序。 在接下來的20年里，測序儀經(jīng)歷了快速演變，在不同程度上優(yōu)化了速度、準(zhǔn)確性、測序深度和讀長等參數(shù)[4]。 各種各樣的測序方法已被開發(fā)出來用于特定的應(yīng)用。雖然相對較新，但最有趣的方法之一是單細胞測序。本文探討了這項技術(shù)是如何工作的，以及它能夠給我們提供什么信息。 01 什么是單細胞測序，什么是單細胞RNA測序？ 傳統(tǒng)的第二代測序（NGS）檢查一個細胞群的基因組，如細胞培養(yǎng)、組織、器官或整個生物體。它的輸出是細胞群的「平均基因組」，而單細胞測序測量的是細胞群中單個細胞的基因組[5]?，F(xiàn)在，傳統(tǒng)方法因此被稱為批量測序，以區(qū)別于單細胞技術(shù)。 目前，單細胞測序技術(shù)可用于測量一個群體中每個細胞的基因組（scDNA-seq）、DNA-甲基組或轉(zhuǎn)錄組（scRNA-seq）。 這些技術(shù)已被用于識別癌細胞中的新突變，探索胚胎發(fā)育過程中發(fā)生的漸進式表觀基因組變化，并評估一個看似同質(zhì)的細胞群是如何表達特定基因的（圖1）[6]。  圖1 | 利用單細胞測序技術(shù)，我們可以在一個看似同質(zhì)的細胞群中確定新的亞群或細胞狀態(tài)。A）顯示了一個細胞群可能表現(xiàn)出異質(zhì)性的不同方式。B）顯示了細胞群中的細胞類型是如何被識別和表征的。 02 單細胞測序是如何工作的？ 所有單細胞測序技術(shù)需要四個主要步驟（圖2）。 1) 從細胞群中分離出單細胞。 2) 提取、處理和擴增每個分離的細胞的遺傳物質(zhì)。 3) 制備包括分離細胞遺傳物質(zhì)的「測序庫」。 4) 使用第二代測序儀對該庫進行測序。  圖2 | 單細胞測序工作流程，根據(jù)所關(guān)注的遺傳物質(zhì)，樣品制備過程略有不同。然而，在所有情況下，產(chǎn)生的測序材料是每個細胞的條形碼DNA或cDNA庫，然后可以在選擇的測序平臺上測序。 2.1、細胞的分離和基礎(chǔ)樣品處理 細胞可以用不同的方法進行分離[7,8]，其選擇主要取決于樣品的性質(zhì)和細胞分離后需要的處理步驟。 每種方法的性能由其效率（每單位時間可分離多少細胞）、純度（收集到的目標(biāo)細胞的比例）和回收率（收集到的目標(biāo)細胞與最初可用的目標(biāo)細胞總數(shù)相比的比例）決定。下面，讓我們介紹一些最常用的技術(shù)[9]： ? 熒光激活細胞分選（FACS）：包括用附著在目標(biāo)特異性抗體上的熒光分子來標(biāo)記細胞選擇所依據(jù)的細胞蛋白。細胞內(nèi)的標(biāo)記物可以通過細胞通透性來獲取。因此，該技術(shù)允許根據(jù)多個參數(shù)來選擇細胞。然而，F(xiàn)ACS需要>10,000個起始細胞，而且快速流動可能會損害細胞的生存能力[7]； ? 磁激活細胞分選（MACS）：使用抗體介導(dǎo)的超順磁納米粒子來標(biāo)記目標(biāo)細胞上的特定蛋白質(zhì)。然而，這意味著，與FACS不同，只有細胞表面分子可以作為標(biāo)記活細胞的目標(biāo)[10]，然后使用外部磁場來隔離被標(biāo)記的細胞，而其他細胞則被洗掉。因此，MACS分離的純度取決于用于標(biāo)記的抗體的特異性和親和力； ? 激光捕獲顯微切割（LCM）：使用激光從放置在顯微鏡玻片上的固體組織樣本中分離出目標(biāo)細胞。隔離可以通過兩種方式進行：直接，當(dāng)紅外光將激光能量轉(zhuǎn)移到只與目標(biāo)細胞特異性結(jié)合的熱可塑性聚合物上時；間接，當(dāng)紫外光消融細胞時。與FACS和MACS不同，LCM可用于完整的組織。它也是快速和可靠的。然而，LCM需要通過目視檢查其形態(tài)來識別目標(biāo)細胞。另外，細胞在分離過程中可能被切片，紫外線可能會損害DNA和RNA分子[11]； ? 手工挑選細胞：又被稱為微操作，需要一個倒置的顯微鏡，結(jié)合微吸管來選擇和分離目標(biāo)細胞。微操作已經(jīng)被用于活體培養(yǎng)和胚胎細胞。然而，它的產(chǎn)量是有限的，而且與LCM一樣，該技術(shù)需要熟練的專業(yè)人員來正確識別目標(biāo)細胞[12]。 在進行文庫制備之前，要對細胞分離的質(zhì)量進行評估，并通過成像評估細胞的活力。 RNA的完整性也可以被評估，這對scRNA-seq分析特別重要。然后對分離的細胞進行裂解，相關(guān)的遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）被分離和擴增，以提供足夠的后續(xù)檢測，因為單細胞通常只產(chǎn)生極少量的DNA或RNA。 這些步驟產(chǎn)生的材料是單鏈DNA，甚至用于scRNA-seq分析，我們將在下文中進行解釋。已經(jīng)制定了一些方案來處理特定研究的要求和限制，例如在可用細胞數(shù)量少的情況下[13]。 2.2、測序文庫的制備 為了對擴增的DNA進行測序，首先需要將其制成一個測序文庫[13,14]。測序文庫是來自一個細胞群的單鏈DNA片段的集合，或者在單細胞測序的情況下，來自一個特定的細胞。 擴增后，DNA片段被唯一的條碼化，以識別它們屬于哪個起始細胞，并在5'和3'端添加特定的適配序列。 需要測序的DNA部分通常被命名為插入物，條形碼和適配體在插入物的一端或兩端加蓋，屬于同一測序庫的所有DNA片段都使用相同的寡核苷酸序列進行條碼化。 這允許在同一測序過程中把不同的文庫集中在一起進行測序，適配體取決于平臺，需要對片段進行測序。所有的樣品和文庫制備步驟都有商業(yè)試劑盒。為了確保得到的文庫準(zhǔn)確地再現(xiàn)原始細胞的狀態(tài)，有幾種質(zhì)量控制的方式（圖3）[15]。  圖3 | 評估文庫制備和測序結(jié)果的質(zhì)量控制，在這個例子中，單細胞是通過FACS方法分離出來的。 2.3、測序 各種商業(yè)上可用的測序平臺已經(jīng)開發(fā)出略有不同的方法。在此，我們重點討論通過合成方法進行測序，包括火法測序（pyrosequencing）和可逆終止器測序等變化。 在測序之前，一個擴增步驟通常會產(chǎn)生一組DNA片段克?。ㄍǔＭㄟ^橋式擴增或乳化PCR）。由于每組克隆在測序過程中發(fā)出相同的信號，因此產(chǎn)生的簇或孔信號足夠強，可以進行檢測[16]。 這種類型的測序通常在一個芯片內(nèi)進行，它可能包含微孔。適配體和其他分子，如聚合酶，被綁定在芯片上（或微孔的底部），并與連接在插入物上的適配體相互作用。 然后，插入物測序需要多個復(fù)制步驟，由聚合酶執(zhí)行，并使用熒光標(biāo)記的核苷酸。 在每個周期中，加入一個熒光標(biāo)記的核苷酸，如果被聚合酶結(jié)合，就會觸發(fā)特定核苷酸的光發(fā)射。 在下一個周期開始前，所有片段同時發(fā)出的光譜通過攝像機被記錄下來。當(dāng)每個核苷酸發(fā)出不同的光時，測序儀就會逐個周期地重建所有插入物的序列。測序儀還讀取插入物的標(biāo)簽，將每個測量結(jié)果分配到相應(yīng)的庫中。 質(zhì)子檢測測序（Proton detection sequencing）使用一種不同的合成測序方法。片段通常被綁定在珠子上，并被擴增以覆蓋每個珠子（類似于熱測序）。然而，當(dāng)堿基在測序過程中被添加時，它不是一個熒光標(biāo)簽和光釋放，而是釋放一個質(zhì)子，然后可以被檢測和記錄。 另一種不太常見的測序方法是結(jié)扎法測序（sequencing by ligation）。這種方法使用DNA連接酶而不是DNA聚合酶，連接熒光標(biāo)記的短序列而不是核苷酸。 在測序之前，通常使用乳劑PCR擴增化學(xué)方法對DNA片段進行擴增。由于插入物的每個核苷酸隨后被測序兩次，這種方法提供非常準(zhǔn)確的讀數(shù)。然而，結(jié)扎測序只能輸出較短的讀數(shù)，而且與回文序列不兼容。 03 單細胞測序的類型 單細胞測序技術(shù)可以測量不同類型的遺傳物質(zhì)，單細胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組或甲基組。本部分內(nèi)容解釋了樣品制備的主要差異（圖2）和這三種測序亞型的最相關(guān)應(yīng)用。 3.1、單細胞基因組測序 通過確定單細胞的基因組，scDNA-seq可以對細胞群的基因組異質(zhì)性進行研究[17]。 因此，它主要用于研究微生物組和癌癥。微生物組是單細胞生物的社區(qū)，scDNA-seq測量其微生物成分的基因組，而不需要先分離和培養(yǎng)它們。 然后，測序數(shù)據(jù)可用于研究微生物組的組成，從而研究其生態(tài)學(xué)、進化和改變[18,19]。 在癌癥研究中，scDNA-seq被用來研究腫瘤內(nèi)的遺傳異質(zhì)性或識別新型致癌突變[20,21]。由于這些創(chuàng)新能力，scDNA-seq大大促進了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展[22]。 對于scDNA-seq，從分離的細胞中提取的DNA最常使用多重置換擴增法（MDA）或多重退火和循環(huán)擴增循環(huán)法（MALBAC）[23]。 MDA允許快速擴增微量的DNA，提供一個優(yōu)秀但不均勻的基因組覆蓋。另一方面，MALBAC提供的基因組覆蓋率較低但更均勻，因此更適合檢測拷貝數(shù)變異。 如前所述，庫是由擴增的DNA生成的。為了使這種方法成功，均勻和有效的擴增是至關(guān)重要的。 然而，沒有一種擴增方法是無懈可擊的。特別是檢測單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和拷貝數(shù)變異的效率往往很低。因此，不同的擴增方法已經(jīng)被開發(fā)出來，以改善對特定突變類型的檢測[24]。 3.2、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（單細胞RNA測序，單細胞RNA-seq，或scRNA seq） scRNA-seq測量給定樣本中每個細胞內(nèi)的RNA分子。這一信息提供了細胞收獲時轉(zhuǎn)錄組（正在轉(zhuǎn)錄的基因）的快照[25,26]。 自從開發(fā)以來，scRNA-seq已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的應(yīng)用，雖然一個基因表達的最終產(chǎn)品是蛋白質(zhì)，但檢測其信使RNA（mRNA）表明該基因被打開，因此，有可能隨后被翻譯和表達。 此外，共同轉(zhuǎn)錄的基因可用于推斷特定細胞表型所依據(jù)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[27]，細胞群的轉(zhuǎn)錄差異可以幫助識別亞群，如腫瘤塊的惡性細胞[28]。 scRNA-seq也被用來研究重要的基因轉(zhuǎn)錄特征，如剪接模式和單倍體基因轉(zhuǎn)錄[29,30]。由于細菌細胞中mRNA拷貝數(shù)低和RNA不穩(wěn)定等因素，原核生物scRNA-seq一直是個問題。然而，這些問題正在逐漸被克服[31,32]。 分離的細胞被裂解，它們的mRNA分子是多腺苷酸化的，用poly[T]-primers來富集。 這是一個關(guān)鍵步驟，因為細胞中的大多數(shù)RNA分子是核糖體（rRNA）：非常大，而且通常不是轉(zhuǎn)錄組測序的目標(biāo)。 接下來，逆轉(zhuǎn)錄酶將聚[T]引物、單鏈mRNA轉(zhuǎn)換成互補DNA（cDNA）。然后用PCR或體外轉(zhuǎn)錄（IVT）來擴增cDNA分子。 最后，條形碼標(biāo)簽和測序平臺要求的其他短序列被添加到cDNA分子中[26]。 這種技術(shù)的測序質(zhì)量受一些因素的影響，主要是可以從一個細胞群中得到的文庫總數(shù)和檢測到的讀數(shù)。 理想的細胞數(shù)量取決于不同細胞亞群或狀態(tài)的預(yù)期數(shù)量。讀數(shù)的數(shù)量表明一個轉(zhuǎn)錄組被測序的深度，這取決于基因組的大小，更高的讀數(shù)深度提供更可靠的細節(jié)，樣品和文庫制備方案也會影響結(jié)果的質(zhì)量。 3.3、單細胞DNA甲基組測序 DNA甲基化涉及到將一個甲基轉(zhuǎn)移到一個胞嘧啶碳（通常是C5）上。甲基化是一種表觀遺傳機制，它改變了DNA的活性而不影響其序列，當(dāng)在基因啟動子中時，DNA甲基化通常會抑制該基因的轉(zhuǎn)錄[33]。 因此，單細胞DNA甲基組測序（scDNA-Met-seq）可以用來研究在一個原本基因相同的細胞群中的表觀遺傳變化，引起不同的表型。 DNA甲基化對細胞身份也至關(guān)重要，是X染色體失活、基因組印記、可轉(zhuǎn)錄元素的壓制、衰老和致癌的關(guān)鍵。這項技術(shù)主要用于發(fā)育研究[34]，但也被用于探索罕見的和極其活躍的腫瘤細胞亞群[35]。 scDNA-Met-seq的樣本和文庫制備與scDNA-seq類似，但多了一個步驟。在擴增之前，DNA要經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理，它只將非甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶殘基則不受影響[36]。 然而，亞硫酸氫鹽處理往往會使DNA碎片化和降解。其他方法，如甲基化敏感的限制性酶，已經(jīng)被探索過，但仍不能用于單細胞測序。 04 分析單細胞測序數(shù)據(jù) 測序儀的最終原始輸出首先在測序機內(nèi)直接處理，返回二進制堿基調(diào)用（BCL）文件和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 BCL文件是二進制格式的原始測序輸出，為了進一步分析，BCL文件然后被轉(zhuǎn)換成FASTQ文件，一個包含序列信息和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的文本文件（圖3）。 這一步驟通常是在使用條形碼標(biāo)簽對來自不同庫的數(shù)據(jù)進行解復(fù)用后，在Linux服務(wù)器上進行。 可以對FASTQ文件進行處理，使序列與模板基因組相一致，對其進行注釋，檢測變體，進行差異轉(zhuǎn)錄分析，并將數(shù)據(jù)可視化[37,38]。 一些第三方學(xué)術(shù)機構(gòu)開發(fā)的腳本可用于執(zhí)行這些初步分析[39,40]，鑒于FASTQ數(shù)據(jù)文件的大小（通常每個10~200G），這些分析的計算成本很高，因此，通常在Linux服務(wù)器上使用其命令行進行。 由此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以使用數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計工具進一步調(diào)查，如數(shù)據(jù)歸一化、主成分分析、t分布的隨機鄰居嵌入分析、聚類分析和路徑或基因組富集分析。 這些工具在探索大型數(shù)據(jù)集時很有幫助，因為它們可以識別出意想不到的模式和生物行為，以及最顯著地驅(qū)動特定表型的基因或轉(zhuǎn)錄物。 特別是，Bioconductor是一個為R統(tǒng)計編程語言開發(fā)的雜項包，為基因組學(xué)數(shù)據(jù)的分析提供免費的開源軟件[41]。該軟件包內(nèi)的工具被設(shè)計用來進行上述分析并將其結(jié)果可視化。某些工作流程和功能已經(jīng)專門為單細胞測序分析進行了優(yōu)化[42,43]。 05 單細胞測序的作用 一個組織或器官內(nèi)的每個細胞以不同的方式對整個機體的生理/病理做出貢獻。 利用單細胞技術(shù)，我們可以探測每個細胞，并測量其對整個細胞群，以及其有機體或生態(tài)系統(tǒng)的具體貢獻。 這種獨特的細節(jié)水平在研究稀有細胞或探索同細胞類型群體中的表型變化時特別有價值。 例如，scRNA-seq已被用于研究罕見的抗原特異性T或B細胞[44]，測量人類微生物組的組成和結(jié)構(gòu)[45]，研究抗化療腫瘤亞群的起源和發(fā)展[46]，發(fā)現(xiàn)植物組織中以前未知的基因功能[47]，研究腫瘤進展機制并根據(jù)腫瘤內(nèi)細胞異質(zhì)性進行預(yù)后預(yù)測[48]。 由于單細胞測序技術(shù)的獨特性，這些以及更多的應(yīng)用已經(jīng)在各個領(lǐng)域成為可能。 06 單細胞測序技術(shù)和其他技術(shù)的聯(lián)合使用 現(xiàn)在，各種全息技術(shù)經(jīng)常被結(jié)合起來，研究單細胞的多層次狀態(tài)[49,50]。通過結(jié)合之前描述的測序技術(shù)，有可能研究同一細胞群中的基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組景觀[51,52]。 測序技術(shù)也經(jīng)常與蛋白質(zhì)組學(xué)方法相結(jié)合，包括代謝組學(xué)、磷蛋白組學(xué)、乙酰組學(xué)和糖蛋白組學(xué)[53,54]。結(jié)合不同的單細胞全貌學(xué)方法，可以更深入地了解細胞群的異質(zhì)性，也可以識別更多的亞群，因為其他技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)不同類型的變化。 也有可能推斷出一種全息技術(shù)觀察到的變化與另一種技術(shù)觀察到的變化之間的功能聯(lián)系。這些信息可以幫助確定新的因果關(guān)系，從而確定一個已知表型背后的機制。 已經(jīng)有一些計算方法被開發(fā)出來，用于整合不同的全能基因數(shù)據(jù)集[55,56]，包括創(chuàng)新的、基于機器學(xué)習(xí)的方法[57]。 然而，整合多組學(xué)單細胞數(shù)據(jù)的算法往往仍不充分。雖然文庫制備方案和測序技術(shù)已經(jīng)非常完善，但數(shù)據(jù)分析工具已經(jīng)滯后，現(xiàn)在可能構(gòu)成了這個領(lǐng)域最大的挑戰(zhàn)。 向上滑動閱覽 參考文獻 [1] Jou WM, Haegeman G, Ysebaert M, Fiers W. Nucleotide sequence of the gene coding for the bacteriophage MS2 coat protein. Nature. 1972;237(5350):82-88. doi:10.1038/237082a0 [2] Sanger F, Air GM, Barrell BG, et al. Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA. Nature. 1977;265(5596):687-695. doi:10.1038/265687a0 [3] Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al. The sequence of the human genome. Science. 2001;291(5507):1304-1351. doi:10.1126/science.1058040 [4] Liu L, Li Y, Li S, et al. Comparison of next-generation sequencing systems. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:1-11. doi:10.1155/2012/251364 [5] Tang X, Huang Y, Lei J, Luo H, Zhu X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell Biosci. 2019;9(1):53. doi:10.1186/s13578-019-0314-y [6] Mannarapu M, Dariya B, Bandapalli OR. Application of single-cell sequencing technologies in pancreatic cancer. Mol Cell Biochem. 2021;476(6):2429-2437. doi:10.1007/s11010-021-04095-4 [7] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for single-cell isolation. Int J Mol Sci. 2015;16(8):16897-16919. doi:10.3390/ijms160816897 [8] Valihrach L, Androvic P, Kubista M. Platforms for single-cell collection and analysis. Int J Mol Sci. 2018;19(3):807. doi:10.3390/ijms19030807 [9] Hu P, Zhang W, Xin H, Deng G. Single cell isolation and analysis. Front Cell Dev Biol. 2016;4. doi:10.3389/fcell.2016.00116 [10] Welzel G, Seitz D, Schuster S. Magnetic-activated cell sorting (MACS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 2015;5(1):7959. doi:10.1038/srep07959 [11] Espina V, Wulfkuhle JD, Calvert VS, et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 2006;1(2):586-603. doi:10.1038/nprot.2006.85 [12] Citri A, Pang ZP, Südhof TC, Wernig M, Malenka RC. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells. Nat Protoc. 2012;7(1):118-127. doi:10.1038/nprot.2011.430 [13] Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, et al. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies. Biotechnol Adv. 2020;41:107537. doi:10.1016/j.biotechadv.2020.107537 [14] Syed F, Grunenwald H, Caruccio N. Next-generation sequencing library preparation: simultaneous fragmentation and tagging using in vitro transposition. Nat Methods. 2009;6(11):i-ii. doi:10.1038/nmeth.f.272 [15] Endrullat C, Gl?kler J, Franke P, Frohme M. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Appl Transl Genom. 2016;10:2-9. doi:10.1016/j.atg.2016.06.001 [16] Pareek CS, Smoczynski R, Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. J Appl Genet. 2011;52(4):413-435. doi:10.1007/s13353-011-0057-x [17] Gawad C, Koh W, Quake SR. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat Rev Genet. 2016;17(3):175-188. doi:10.1038/nrg.2015.16 [18] Kashtan N, Roggensack SE, Rodrigue S, et al. Single-cell genomics reveals hundreds of coexisting subpopulations in wild prochlorococcus. Science. 2014;344(6182):416-420. doi:10.1126/science.1248575 [19] Swan BK, Tupper B, Sczyrba A, et al. Prevalent genome streamlining and latitudinal divergence of planktonic bacteria in the surface ocean. PNAS. 2013;110(28):11463-11468. doi:10.1073/pnas.1304246110 [20] Zhang L, Dong X, Lee M, Maslov AY, Wang T, Vijg J. Single-cell whole-genome sequencing reveals the functional landscape of somatic mutations in B lymphocytes across the human lifespan. PNAS. 2019;116(18):9014-9019. doi:10.1073/pnas.1902510116 [21] Francis JM, Zhang CZ, Maire CL, et al. EGFR variant heterogeneity in glioblastoma resolved through single-nucleus sequencing. Cancer Discov. 2014;4(8):956-971. doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0879 [22] Wiedmeier JE, Noel P, Lin W, von Hoff DD, Han H. Single-cell sequencing in precision medicine. Cancer Treat Res. Published online 2019:237-252. doi:10.1007/978-3-030-16391-4_9 [23] Chen M, Song P, Zou D, et al. Comparison of multiple displacement amplification (MDA) and multiple annealing and looping-based amplification cycles (MALBAC) in single-cell sequencing. PLoS ONE. 2014;9(12):e114520. doi:10.1371/journal.pone.0114520 [24] Treff NR, Su J, Tao X, Northrop LE, Scott RT. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Basic Sci Repro Med. 2011;17(6):335-343. doi:10.1093/molehr/gaq103 [25] Kolodziejczyk AA, Kim JK, Svensson V, Marioni JC, Teichmann SA. The technology and biology of single-cell RNA sequencing. Mol Cell. 2015;58(4):610-620. doi:10.1016/j.molcel.2015.04.005 [26] Haque A, Engel J, Teichmann SA, L?nnberg T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 2017;9(1):75. doi:10.1186/s13073-017-0467-4 [27] Wagner A, Regev A, Yosef N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 2016;34(11):1145-1160. doi:10.1038/nbt.3711 [28] Tirosh I, Izar B, Prakadan SM, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science. 2016;352(6282):189-196. doi:10.1126/science.aad0501 [29] Shalek AK, Satija R, Adiconis X, et al. Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells. Nature. 2013;498(7453):236-240. doi:10.1038/nature12172 [30] Deng Q, Ramsk?ld D, Reinius B, Sandberg R. Single-cell RNA-seq reveals dynamic, random monoallelic gene expression in mammalian cells. Science. 2014;343(6167):193-196. doi:10.1126/science.1245316 [31] Imdahl F, Vafadarnejad E, Homberger C, Saliba A-E, Vogel J. Single-cell RNA-sequencing reports growth-condition-specific global transcriptomes of individual bacteria. Nat Microbiol. 2020;5(10):1202-1206. doi:10.1038/s41564-020-0774-1 [32] Kuchina A, Brettner LM, Paleologu L, et al. Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. Science. 2021;371(6531):eaba5257. doi:10.1126/science.aba5257 [33] Moore LD, Le T, Fan G. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacology. 2013;38(1):23-38. doi:10.1038/npp.2012.112 [34] Zhu P, Guo H, Ren Y, et al. Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. Nat Genet. 2018;50(1):12-19. doi:10.1038/s41588-017-0007-6 [35] Gkountela S, Castro-Giner F, Szczerba BM, et al. Circulating tumor cell clustering shapes DNA methylation to enable metastasis seeding. Cell. 2019;176(1-2):98-112.e14. doi:10.1016/j.cell.2018.11.046 [36] Smallwood SA, Lee HJ, Angermueller C, et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nat Methods. 2014;11(8):817-820. doi:10.1038/nmeth.3035 [37] Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29(1):15-21. doi:10.1093/bioinformatics/bts635 [38] Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 2012;7(3):562-578. doi:10.1038/nprot.2012.016 [39] Bray NL, Pimentel H, Melsted P, Pachter L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nat Biotechnol. 2016;34(5):525-527. doi:10.1038/nbt.3519 [40] Bankevich A, Nurk S, Antipov D, et al. SPAdes: A new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012;19(5):455-477. doi:10.1089/cmb.2012.0021 [41] Lawrence M, Huber W, Pagès H, et al. Software for computing and annotating genomic ranges. PLoS Comput Biol. 2013;9(8):e1003118. doi:10.1371/journal.pcbi.1003118 [42] Amezquita RA, Lun ATL, Becht E, et al. Orchestrating single-cell analysis with Bioconductor. Nat Methods. 2020;17(2):137-145. doi:10.1038/s41592-019-0654-x [43] Perraudeau F, Risso D, Street K, Purdom E, Dudoit S. Bioconductor workflow for single-cell RNA sequencing: Normalization, dimensionality reduction, clustering, and lineage inference. F1000Research. 2017;6:1158. doi:10.12688/f1000research.12122.1 [44] Shalek AK, Satija R, Adiconis X, et al. Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells. Nature. 2013;498(7453):236-240. doi:10.1038/nature12172 [45] Balachandran M, Cross KL, Podar M. Single-cell genomics and the oral microbiome. J Dent Res. 2020;99(6):613-620. doi:10.1177/0022034520907380 [46] Kim C, Gao R, Sei E, et al. Chemoresistance evolution in triple-negative breast cancer delineated by single-cell sequencing. Cell. 2018;173(4):879-893.e13. doi:10.1016/j.cell.2018.03.041 [47] Wendrich JR, Yang B, Vandamme N, et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 2020;370(6518). doi:10.1126/science.aay4970 [48] Patel AP, Tirosh I, Trombetta JJ, et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 2014;344(6190):1396-1401. doi:10.1126/science.1254257 [49] Lake BB, Chen S, Sos BC, et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nat Biotechnol. 2018;36(1):70-80. doi:10.1038/nbt.4038 [50] Granja JM, Klemm S, McGinnis LM, et al. Single-cell multiomic analysis identifies regulatory programs in mixed-phenotype acute leukemia. Nat Biotechnol. 2019;37(12):1458-1465. doi:10.1038/s41587-019-0332-7 [51] Kashima Y, Sakamoto Y, Kaneko K, Seki M, Suzuki Y, Suzuki A. Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analyses. Exp Mol Med. 2020;52(9):1419-1427. doi:10.1038/s12276-020-00499-2 [52] Lee J, Hyeon DY, Hwang D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Exp Mol Med. 2020;52(9):1428-1442. doi:10.1038/s12276-020-0420-2 [53] Angelidis I, Simon LM, Fernandez IE, et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 2019;10(1):963. doi:10.1038/s41467-019-08831-9 [54] Zhu Y, Scheibinger M, Ellwanger DC, et al. Single-cell proteomics reveals changes in expression during hair-cell development. eLife. 2019;8. doi:10.7554/eLife.50777 [55] Stuart T, Butler A, Hoffman P, et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 2019;177(7):1888-1902.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.05.031 [56] Welch JD, Kozareva V, Ferreira A, Vanderburg C, Martin C, Macosko EZ. Single-cell multi-omic integration compares and contrasts features of brain cell identity. Cell. 2019;177(7):1873-1887.e17. doi:10.1016/j.cell.2019.05.006 57. Erfanian N, Heydari AA, Ia?ez P, et al. Deep learning applications in single-cell omics data analysis. bioRxiv. Published online January 1, 2021:2021.11.26.470166. doi:10.1101/2021.11.26.470166 |
|
|
