細(xì)菌可產(chǎn)生許多能引起抗菌藥物滅活的酶, 主要包括β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶 (AME) .KPN對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要機(jī)制之一是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。它可通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán), 使β-內(nèi)酰胺類藥物水解從而失去抗菌活性, 其水解率是細(xì)菌耐藥性的主要決定因素。KPN產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶主要包括產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (ESBLs) 、質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C酶、耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶 (IRBLs) 及碳青霉烯酶 (KPC酶) 等。

1.1 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 (ESBLs)

ESBLs是KPN耐藥產(chǎn)生的最主要的一類酶。1983年由德國報(bào)告了世界上第一例ESBLs, 1994年在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)現(xiàn)國內(nèi)首例ESBLs感染, 迄今已報(bào)告的ESBLs的代表菌株有肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌等。ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸蛋白衍生物, 通過水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺酶, 導(dǎo)致此類抗菌藥物耐藥, 可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸鉀所抑制, 但羅燕萍等報(bào)道, 產(chǎn)ESBLs的PKN對酶抑制劑復(fù)合抗生素也有較高的耐藥率。

ESBLs以TEM型和SHV型最常見, CTX-M型是我國的主要基因型。TEM型ESBLs主要對青霉素、氨芐西林及頭孢他啶等一代頭孢菌素耐藥, 但對頭孢噻肟敏感, 對舒巴坦和克拉維酸耐藥是所有CTX -M型酶的特點(diǎn)。SHV型ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)或染色體編碼產(chǎn)生, 主要引起細(xì)菌對第一代頭孢菌素和青霉素耐藥, SHV-1型對阿莫西林、氨芐西林等青霉素類抗菌藥物有較強(qiáng)的水解作用。目前用于治療產(chǎn)ESBLs菌所致感染的藥物有碳青霉烯類、頭霉素類抗生素, 亞胺培南具有超廣譜、高效的抗菌活性, 是治療ESBLs菌感染的首選藥物。

1.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C酶

Amp C酶由Amp C基因編碼產(chǎn)生, Amp C基因表達(dá)同時(shí)受Amp D、Amp R、Amp G等多種基因的調(diào)控。質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C酶是由位于腸桿菌屬、假單胞菌屬及沙雷菌屬等菌屬染色體上的Amp C基因通過基因轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)到KPN的質(zhì)粒上, 伴隨細(xì)菌復(fù)制而編碼產(chǎn)生, 其容易引起KPN或大腸埃希菌對第三代頭孢菌素或酶抑制劑的耐藥. 自1988年發(fā)現(xiàn)首例質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C酶MRI-1, 迄今已有40余種基因型, 世界范圍內(nèi)以CMY-2型多見, 國內(nèi)主要為DHA-1型和ACT-1型, 多在克雷伯菌、大腸埃希菌和沙門菌等菌屬中呈持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)傳播。近年還發(fā)現(xiàn)Amp C酶不僅由染色體介導(dǎo), 也可由質(zhì)粒介導(dǎo), 且質(zhì)粒介導(dǎo)者因其具有較快的傳播速度和較強(qiáng)的耐藥性, 導(dǎo)致耐藥性的廣泛傳播, 這都成為臨床抗感染治療較棘手的問題.

質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C酶與ESBLs的區(qū)別在于前者能水解第3代頭孢菌素類、單環(huán)內(nèi)酰類和頭霉素類 (附ACC1外) , 而且不受酶抑制劑的抑制作用, 對類碳青霉烯類藥物或第4代頭孢菌素敏感。。但Wang等研究發(fā)現(xiàn), 缺失一種39×103大小的外膜蛋白的產(chǎn)DHA-1的KPN對碳青霉烯類藥物的敏感性出現(xiàn)不同程度的降低。Bidet等研究發(fā)現(xiàn), 產(chǎn)ACC1的KPN在缺失一種36×103大小的外膜蛋白后, 對亞胺培南產(chǎn)生了耐藥性。

1.3 耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶 (IRBLs)

IRBLs是一種不受酶抑制劑所抑制的β-內(nèi)酰胺酶, 屬于Ambler分子分類的A類、Bush功能分類的2br亞類, TEM型是主要來源, 由TEM-1、 TEM-2、SHV-1基因發(fā)生突變形成, 其他還有SHV-10、SHV-49、OXY-2以及OXA型的β-內(nèi)酰胺酶等。KPN對酶抑制劑的主要耐藥機(jī)制是由質(zhì)粒介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶基因特別是TEM-1基因發(fā)生突變后, 產(chǎn)生了TEM型β-內(nèi)酰胺酶而引起對酶抑制劑耐藥。其特點(diǎn)容易導(dǎo)致KPN對阿莫西林、替卡西林及其酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦及其復(fù)合抗生素耐藥, 但對窄譜頭孢菌素、7-α-甲氧基頭孢菌素和氧亞氨基頭孢菌素敏感。

1.4 碳青霉烯酶 (KPC酶)

KPN對碳青霉烯類最主要的耐藥機(jī)制的是產(chǎn)生KPC酶, 它能水解包含碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素, 而且絕大多數(shù)對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑具有抗性。這些酶以產(chǎn)KPC酶為主, 主要由質(zhì)粒介導(dǎo), 包括Ambler分類的A、D類KPC酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶。KPN容易引起碳青霉烯類、廣譜頭孢菌素類、青霉素類或單環(huán)類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

KPC酶最早由Yigit等于2001年在美國北卡羅來納州的KPN中發(fā)現(xiàn), 屬于KPC-1型;國內(nèi)于2006年首次報(bào)道在一株KPN中檢測到KPC-2。至今已發(fā)現(xiàn)的KPC酶有KPC-1~11共11種類型, 其中以KPC-2和KPC和KPC-3在臨床分離菌株中最為常見, 且是引起大多數(shù)爆發(fā)流行的主要類型。2005年和2011年在美國先后發(fā)生了碳青霉烯類抗生素耐藥的KPN流行。我國2010年CHINET耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)表明, KPN對碳青霉烯類的耐藥率為10%, 由此可見KPC酶介導(dǎo)的耐藥將成為KPN耐藥的重要機(jī)制之一。

另外, KPN也會(huì)產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶 (AME) , 這是引起細(xì)菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。

在KPN中, 編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的par C基因及編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyr A基因靶位出現(xiàn)變異時(shí), 這兩類酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)象容易發(fā)生變化, 致使酶-DNA復(fù)合物與抗菌藥物不能穩(wěn)定結(jié)合，達(dá)不到干擾細(xì)菌DNA合成的作用, 最終引起KPN對喹諾酮類耐藥。gyr A基因變異在基因靶位的變異中起主導(dǎo)作用, 位于gyr A的絲氨酸Ser83和天冬氨酸Asp87, 絲氨酸Ser80和par C的的谷氨酸Glu84是最常見變異位點(diǎn)。高山等研究應(yīng)證了第83位氨基酸的改變是喹諾酮類耐藥的主要原因。

質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qnr是另一種耐藥機(jī)制, 其通過編碼蛋白與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ進(jìn)行特異性結(jié)合, 減少喹諾酮類藥物的作用靶位從而產(chǎn)生細(xì)菌耐藥。李娟等報(bào)道, 在37株KPN中檢測到有7株攜帶qnr S基因, 且全部具有多重耐藥性, 只有對亞胺培南敏感。

3.1 生物被膜 (BF)

BF是細(xì)菌吸附在機(jī)體腔道黏膜表面, 通過分泌多糖蛋白復(fù)合物包繞而形成的膜狀物。BF可通過物理阻擋作用阻止外來大分子物質(zhì)的滲入, 同時(shí)與抗菌藥物結(jié)合制約其進(jìn)入到細(xì)菌生物被膜內(nèi)部, 最終導(dǎo)致細(xì)菌接觸到的抗菌藥物濃度過低產(chǎn)生耐藥。Anderl等通過用10倍MIC濃度的氨芐西林對抗浮游生長和生物被膜狀態(tài)的KPN, 證明BF可以阻止藥物滲入而使氨芐西林產(chǎn)生耐藥性。Yang等還發(fā)現(xiàn)BF菌的特殊結(jié)構(gòu)和生理特性使菌體內(nèi)抗菌藥物濃度明顯降低, 有更多機(jī)會(huì)誘導(dǎo)浮游生長菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而引起耐藥。

3.2 外膜孔蛋白缺失

KPN等革蘭陰性菌細(xì)胞外膜脂多層中存在由許多微孔蛋白組成的孔道, 它是一種非特導(dǎo)性的、跨越細(xì)胞膜的水溶性擴(kuò)散通道, 一些β-內(nèi)酰胺酶類藥物可經(jīng)通道進(jìn)入菌體內(nèi)而發(fā)揮作用。若微孔蛋白發(fā)生改變或缺失, 抗菌藥物將難以滲入細(xì)菌胞內(nèi)而出現(xiàn)耐藥。氨基糖苷類等抗菌藥物因尚有其他通道進(jìn)入, 故影響不大。

KPN的孔蛋白最常見發(fā)生耐藥是Om PK35, 其他還有Om PK36、Om PK37等?？椎鞍椎母淖冊黾蛹?xì)菌耐藥性, 與滅活酶并存時(shí)的耐藥程度比滅活酶單獨(dú)作用時(shí)高。Webster等報(bào)道, Omp K35和Omp K36的缺失可導(dǎo)致KPN對美羅培南耐藥。

在KPN的內(nèi)膜上存在能量依賴性蛋白外排泵的外排系統(tǒng), 能主動(dòng)將滲入細(xì)菌體內(nèi)的的藥物不斷泵出。當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)某種調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生改變, 導(dǎo)致主動(dòng)外排系統(tǒng)表達(dá)亢進(jìn), 使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導(dǎo)致耐藥。這是KPN產(chǎn)生多重耐藥的重要機(jī)制之一。由于這種系統(tǒng)是非專一性的, 廣泛包括內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物在內(nèi)的外排底物, 往往多種主動(dòng)外排系統(tǒng)并存于同一株細(xì)菌，因此可導(dǎo)致細(xì)菌對各種完全不同結(jié)構(gòu)的抗菌藥物的產(chǎn)生耐藥。馬建新等和彭少華等研究發(fā)現(xiàn), 多藥耐藥KPN抗菌制劑外排泵基因攜帶率較高。

整合子是由Hall于1989年首次發(fā)現(xiàn)提出的概念。它是一種能被識別和俘獲的外源性可移動(dòng)基因, 其位于細(xì)菌的質(zhì)粒或染色體上, 是攜帶編碼抗菌藥物耐藥基因盒的DNA片斷, 它具有位點(diǎn)特異性的基因重組系統(tǒng)。研究表明, 整合子不僅能通過介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性群聚而產(chǎn)生多重耐藥性, 而且可在菌種和不同遺傳物質(zhì)間轉(zhuǎn)移, 引起耐藥基因快速廣泛播散。整合子作為遺傳的基因元件普遍存在革蘭陰性菌中, 根據(jù)整合酶基因同源性主要分4類, 與細(xì)菌耐藥性密切相關(guān)主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子。其中Ⅰ類整合子在臨床分離菌株中分布最廣泛, 由5′保守區(qū) (5′CS) 、3′保守區(qū) (3′CS) 和兩者之間的可變區(qū)3個(gè)部分組成, 其攜帶的耐藥基因盒包括對氨基糖苷類、磺胺、喹喏酮類和消毒劑等130多種, 其編碼產(chǎn)物可賦予細(xì)菌對全部臨床常用藥物種類產(chǎn)生耐藥, 因此Ⅰ類整合子是目前整合子研究的熱點(diǎn)。研究表明, 細(xì)菌1個(gè)整合子同時(shí)能夠捕獲多個(gè)基因盒表達(dá)出對不同抗菌藥物的多藥耐藥性, 而整合子內(nèi)部包含某些ESBLs編碼基因更易促使攜帶整合子的產(chǎn)ESBLs菌株表達(dá)出擴(kuò)散優(yōu)勢。研究證明, 在產(chǎn)ESBLs的KPN中已經(jīng)相當(dāng)普遍存在Ⅰ類整合子。Ⅱ類整合子在細(xì)菌中分布比較為局限, 主要分布在志賀菌屬中, 大腸埃希菌、變形菌屬、沙門菌屬等也曾發(fā)現(xiàn)。李濤等從98株KPN中檢出攜帶Ⅱ類整合酶基因的陽性率僅為1%, 提示KPN中Ⅱ類整合子的攜帶率較低。Ⅲ類整合子至今檢出極少。