引言

RNA修飾核苷基本結(jié)構(gòu)

        RNA核苷主要有腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷4種。其結(jié)構(gòu)如圖1。RNA修飾核苷是以上4種基本核苷的堿基或五碳糖上被不同的化學(xué)基團(tuán)修飾后產(chǎn)生的核苷。不同的化學(xué)修飾基團(tuán)以及不同的修飾位點(diǎn)帶來了修飾核苷種類的復(fù)雜性和多樣性。關(guān)于171種已報(bào)道的RNA修飾核苷的結(jié)構(gòu)，大家可以在Modomics 數(shù)據(jù)庫在線查看。

圖1. 4種基本的RNA核苷結(jié)構(gòu)圖

        RMBase V2.0 數(shù)據(jù)庫從涉及13個(gè)物種的47個(gè)研究中分析了566個(gè)數(shù)據(jù)集和1 397 244個(gè)修飾位點(diǎn)，從而統(tǒng)計(jì)得到了下表幾種常見的RNA修飾核苷。其中最多的為m6A。想必大家也曾經(jīng)都被報(bào)道m(xù)6A的paper刷爆過朋友圈。

RNA修飾核苷質(zhì)譜裂解

        RNA修飾核苷在正負(fù)離子模式下都有質(zhì)譜響應(yīng)，正離子模式下的信號通常強(qiáng)于負(fù)離子模式。以腺嘌呤核苷(A)在正離子模式下的質(zhì)譜行為為例介紹RNA修飾核苷主要的質(zhì)譜裂解規(guī)律。從圖2可以看到，RNA修飾核苷的主要的裂解方式為糖苷鍵的斷裂，斷裂后產(chǎn)生一部分的帶電堿基基團(tuán)和另一部分的五碳糖的中性丟失。未被修飾核糖的中性丟失為132Da，當(dāng)核糖被甲基修飾后，可產(chǎn)生146Da的特征中性丟失。根據(jù)修飾核苷的這兩個(gè)特殊的中性丟失可利用132和146Da的中性丟失掃描對其進(jìn)行定性研究。

圖2. 腺嘌呤核苷(A)在正離子模式下的質(zhì)譜裂解方式

        當(dāng)然并不是所有的修飾核苷都是以糖苷鍵斷裂的方式形成它的子離子。就有這么一個(gè)特殊的修飾核苷跟其他修飾核苷的斷裂方式不一樣。這個(gè)特殊的存在就是假尿嘧啶核苷(Pseudouridine,簡寫為Ψ)。Ψ可能的質(zhì)譜裂解見下圖3。它在正離子模式下的特征子離子為125Da。

圖3. 假尿嘧啶核苷(Ψ)在正離子模式下可能的質(zhì)譜裂解方式

RNA修飾核苷LC-MS定量

        根據(jù)part 3中介紹的RNA修飾核苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可以很容易得到其MRM離子通道。下表是幾種常見修飾核苷的MRM離子通道。

        從上表常見RNA修飾核苷的MRM離子通道可以看到。如果用MRM模式定量，A和I、C和U、Cm和Um以及m5C和m5U這四對通道是存在相互干擾的。因?yàn)樵贛RM模式下質(zhì)譜的分辨率通常為±0.5Da(也就是通常說的Unit模式)，上述四對通道的Q1和Q2僅相差1Da，所以如果不在色譜上將其分離，進(jìn)入質(zhì)譜后其MRM通道必會(huì)互相干擾，導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)問題。這個(gè)問題需要引起大家的注意。當(dāng)然對于MRM通道完全一樣的m1A、m2A、m6A和m1G、m7G也是必須要在色譜上達(dá)到規(guī)定的分離度才能保證其定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

        關(guān)于各個(gè)RNA修飾核苷MRM通道的電壓和碰撞能量等參數(shù)，這里將不再介紹，因?yàn)榇蠹宜脙x器型號不同，其參數(shù)也會(huì)不一樣。沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。作者所用的儀器是Sciex 6500和Agilent 6490，有需要的可以聯(lián)系我。下面再簡單說以下RNA修飾核苷的分離色譜柱選擇。

        文獻(xiàn)上報(bào)道的適合分離RNA修飾核苷分離的色譜柱主要為有極性封端的反向C18柱，如Hypersil GOLD aQ 柱(Thermo)，Synergi Fusion 柱（Phenomenex）等。作者本人在實(shí)驗(yàn)過程所選用的色譜柱為Hilic色譜柱。

20種常見RNA修飾核苷絕對定量

        講了這么多，也是時(shí)候展示作者自己的RNA修飾核苷定量方法了，該方法在6min時(shí)間內(nèi)完成了20種常見RNA修飾核苷的分離。其保留時(shí)間、檢測限、定量限定量范圍等見下表。該方法A和I、C和U、Cm和Um以及m5C和m5U這四對存在相互干擾的通道都得到了明顯分離。m1A、m2A、m6A和m1G、m7G也都達(dá)到了定量分離度的要求。

        20種常見RNA修飾核苷的色譜圖如圖4所示。

圖4. 20種常見RNA修飾核苷的色譜圖

結(jié)束語

        本文是液質(zhì)聯(lián)盟的第一篇文章，也是作者的第一篇公眾號文章，歡迎各位同行指正。液質(zhì)聯(lián)盟公眾號建立的初衷就是交流和分享液質(zhì)知識，以后聯(lián)盟的每一篇文章也必定是良心之作。希望大家多多支持液質(zhì)聯(lián)盟。最后歡迎有需要RNA修飾核苷定量的同行交流合作！