 解螺旋公眾號·陪伴你科研的第2213天 m6A修飾全面綜述 近年來，m6A RNA修飾的研究已成為當今生命科學(xué)領(lǐng)域最前沿最熱門的研究方向之一，不斷有CNS的文章問世，國自然資助的項目數(shù)量也逐年上升。 m6A是什么，m6A調(diào)控因子、m6A檢測方法有哪些，m6A在人類疾病中扮演哪些作用。本文將做一簡明闡述。  m6A概念 N6-methyladenosine也叫m6A，是一種廣泛存在于mRNA上的堿基修飾行為，mRNA的內(nèi)部修飾則用于維持mRNA的穩(wěn)定性。 mRNA最常見的內(nèi)部修飾包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羥基化（m5C）等。N6-甲基腺嘌呤(m6A)在 mRNA 內(nèi)部修飾堿基中所占比例最大，主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。 早在20世紀70年代，Desrosiers. R等在人哺乳動物細胞的 mRNA 中發(fā)現(xiàn)了m6A的存在，但m6A的功能以及作用機制卻一直鮮有研究。 直到 2011 年，芝加哥大學(xué)何川教授團隊在 Nat Chem Biol 發(fā)表文章“N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”，揭示m6A的可逆化修飾，使 m6A 的研究重新熱門起來。 圖1 RNA常見的堿基修飾行為 m6A的分子改變是什么？從圖2中我們可以看到，這是一個已經(jīng)發(fā)生甲基化的核糖核苷酸，確切地說叫N6-methyladenosine。一共分為2個大的結(jié)構(gòu)，左下角的是五碳糖，圖2中a框部分也就是五碳糖的第二位C處的羥基發(fā)生脫氧就會變成脫氧核糖核苷酸（從RNA變成DNA）。圖2中c框部分標注的，也就是第四位的C處通常會帶有磷酸基。圖2中b框部分通常就是我們所說的含氮堿基。這里特指腺苷酸（A），當腺苷酸的第六位N處發(fā)生甲基化時，就是我們所說的m6A。 圖2 N6-甲基化腺苷酸結(jié)構(gòu)示意圖 m6A調(diào)控因子 m6A這種甲基化修飾是可逆化的，調(diào)控因子包括甲基化轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白等。甲基化轉(zhuǎn)移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用是催化mRNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是對已發(fā)生m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾。閱讀蛋白主要功能是識別發(fā)生m6A修飾的堿基，從而激活下游的調(diào)控通路如RNA降解、miRNA加工等。 圖3 參與m6A的酶類 圖4 m6A調(diào)控 甲基化轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）也稱為Writers，能夠讓mRNA上的堿基發(fā)生m6A甲基化修飾。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都屬于m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶的核心蛋白。這些蛋白會形成復(fù)合物（complex），共同行使催化功能。 圖5 METTL3、METTL14及其復(fù)合物結(jié)構(gòu) m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全稱Fat mass and obesity-associated protein，屬于Alkb蛋白家族中的一員并且與肥胖相關(guān)。2011年，芝加哥大學(xué)何川教授團隊首次證實， FTO蛋白是一種重要的去甲基化酶。ALKBH5是另一種重要的去甲基化酶，對細胞核中的mRNA進行去甲基化修飾。在細胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修飾水平顯著上升。 發(fā)生m6A修飾的mRNA想要行使特定的生物學(xué)功能，需要甲基化閱讀蛋白，也稱為reader。閱讀蛋白主要包括YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。這些閱讀蛋白的功能主要包括特異性結(jié)合m6A甲基化區(qū)域，削弱與RNA結(jié)合蛋白同源結(jié)合以及改變RNA二級結(jié)構(gòu)從而改變蛋白與RNA的互作。 m6A檢測方法 目前檢測m6A所用的技術(shù)手段包括高通量測序、比色法以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS），常用的方法主要包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS以及比色法。其中LC-MS/MS和比色法能夠檢測mRNA整體的m6A水平，而MeRIP-seq和miCLIP-seq屬于高通量測序手段。 LC-MS/MS在液相質(zhì)譜的基礎(chǔ)上采用串聯(lián)質(zhì)譜，獲得分子離子峰和碎片離子峰，對堿基同時進行定性和定量分析。 LC-MS/MS法第一步使用TRIzol提取完總 RNA后，可以用oligodT磁珠或者rRNA去除試劑盒獲得包括mRNA、lncRNA等在內(nèi)的RNA。 第二步使用核酸酶P1（Nuclease P1）將RNA消化成單個堿基。 第三步加入堿性磷酸酶和碳酸氫銨后孵育數(shù)小時，將樣本注射入液相色譜儀，計算各個堿基的含量。 第四步進入質(zhì)譜串聯(lián)分析，單個核糖核苷酸會被打斷成五碳糖和嘧啶或嘌呤。最后根據(jù)m6A和總腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整體的甲基化程度。
圖6 m6A檢測方法 （A）LC-MS/MS法；（B）比色法。 2012年之前，全基因組或全轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定m6A修飾的研究領(lǐng)域是一片空白。2012年Meyer K. D發(fā)表于Cell上的論文“Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons”和Dominissini D發(fā)表于Nature上的論文“Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq”第一次從轉(zhuǎn)錄水平上，大范圍、高通量地鑒定了人和小鼠m6A的甲基化水平。 這種方法被稱為MeRIP-seq或m6A-seq。 MeRIP-seq操作第一步先對mRNA進行片段化，接下來使用帶有m6A抗體的免疫磁珠對發(fā)生m6A甲基化的mRNA片段進行富集，然后將富集到的mRNA片段純化后構(gòu)建高通量測序文庫進行上機測序。另外需要單獨構(gòu)建一個普通的轉(zhuǎn)錄組文庫作為對照。最后將2個測序文庫放在一起進行生物信息學(xué)分析，得到m6A甲基化程度較高的區(qū)域（m6A peak）。 這種方法優(yōu)點是方便快捷成本低廉，可以對發(fā)生高甲基化的mRNA區(qū)域進行一個定性分析。但是MeRIP-seq只能鑒定m6A高甲基化的區(qū)域，并不能做到單堿基的分辨率。 2015年，Bastian Linder等發(fā)表在Nature Methods的文章“Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome”，第一次從單堿基的水平測定m6A。 這種技術(shù)被稱為miCLIP-seq。 miCLIP-seq操作第一步對富集完的mRNA進行片段化。 第二步，使用帶有m6A抗體免疫磁珠與帶有m6A的mRNA片段進行結(jié)合。 第三步，使用紫外交聯(lián)進行免疫共沉淀后，在mRNA片段的3’端連上接頭序列，在5’端加上P32放射性標記后進行移膜。 第四步，根據(jù)放射性標記進行切膜回收后，對mRNA片段進行反轉(zhuǎn)錄和純化回收。 第五步，對反轉(zhuǎn)錄組的cDNA進行環(huán)化。 第六步，對環(huán)化的cDNA進行復(fù)線性化，然后構(gòu)建測序文庫上機測序。
圖7 高通量測序檢測m6A （A）MeRIP-seq；（B）miCLIP-seq  m6A在疾病中的研究熱點（2020年） 1. 腫瘤 2020年3月發(fā)表于Cancer Cell上的綜述性文章“m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer”，文章指出，m6A相關(guān)修飾酶在腫瘤中的變化不盡相同，環(huán)境改變和位點突變均可導(dǎo)致m6A狀態(tài)的改變，同時m6A參與一些腫瘤靶向治療基因的調(diào)控。
圖8 m6A相關(guān)修飾酶在腫瘤中的變化 2. 病毒感染 2020年2月發(fā)表于Nature Microbiology上的文章“N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I”，文章指出，人類偏肺病毒（HMPV）在其RNA中獲得m6A，可以模仿正常細胞的RNA，躲避免疫系統(tǒng)的檢測。
圖9 病毒中m6A的作用 3. 神經(jīng)脫髓鞘改變 2020年1月發(fā)表于Neuron上的文章“m6A mRNA Methylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination”，文章指出，m6A去甲基化酶METTL14的減少會導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞的減少及中樞神經(jīng)的脫髓鞘改變，提示m6A在神經(jīng)細胞的發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
圖10 m6A對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控。 m6A的研究熱點不斷升級，今后會有更多的高分文章出現(xiàn)，關(guān)聯(lián)的疾病也會越來越多。 但是，m6A的檢測方法較為繁瑣，所需費用也比較高，限制的m6A的研究進展以及臨床應(yīng)用，發(fā)展快速簡便經(jīng)濟的檢測方法是今后m6A檢測技術(shù)的發(fā)展方向。 同時在研究層面，m6A作為十分重要的 RNA 表觀遺傳學(xué)修飾，如何與 DNA、組蛋白表觀遺傳學(xué)協(xié)同作用調(diào)控基因表達，也需要進一步深入探索。
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