宏基因組研究揭示大熊貓的腸道菌群可能并沒有特化出發(fā)酵纖維的能力

撰文：和平鴿 中科院動(dòng)物研究所

責(zé)編：劉永鑫 中科院遺傳發(fā)育所

原文連接
Guo W, Mishra S, Zhao J, Tang J, Zeng B, Kong F, Ning R, Li M, Zhang H, Zeng Y and others. 2018. Metagenomic study suggests that the gut microbiota of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca) may not be specialized for fiber fermentation. Frontiers in Microbiology 9(229). DOI： 10.3389/fmicb.2018.00229

小結(jié)

1. 大熊貓腸道菌群在功能上與熊等食肉動(dòng)物更為近似，而明顯不同于植食類群。

2. 大熊貓胃腸道菌群中與纖維素、半纖維素、氨基酸消化和生物反應(yīng)相關(guān)酶富集相關(guān)的基因的豐富度與食肉類哺乳動(dòng)物類似。

3. 酶活性分析顯示大熊貓腸道菌群中纖維素酶和木聚糖酶和其它植食性動(dòng)物相比處于最低水平。

4. 大熊貓腸道菌群并沒有產(chǎn)生消化竹子中纖維素和半纖維素的特化。

摘要

大熊貓擁有和別的食肉動(dòng)物類似的短而簡(jiǎn)單的胃腸消化系統(tǒng)，但是卻以竹子為主要食物，這一現(xiàn)象使其成為現(xiàn)生哺乳動(dòng)物中的神秘物種。近年來，除了針對(duì)大熊貓自身取得的突出研究進(jìn)展，其取食習(xí)性的適應(yīng)性現(xiàn)狀也是生物科學(xué)領(lǐng)域存在較大爭(zhēng)議的問題。為了解決這一難題，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省農(nóng)畜遺傳資源勘查與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李英教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)及其合作伙伴使用短讀長宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)大熊貓的糞便進(jìn)行了研究，并將大熊貓糞便樣品的宏基因組數(shù)據(jù)與哺乳動(dòng)物中的植食類、肉食類和雜食類進(jìn)行了對(duì)比。

研究結(jié)果揭示大熊貓腸道菌群與熊等食肉動(dòng)物更為近似，而明顯不同于植食類群。這些植食類群腸道菌群中的微生物組成的代謝潛能顯著不同于大熊貓和其它哺乳動(dòng)物。此外，大熊貓腸道菌群中與纖維素、半纖維素、氨基酸消化以及生物反應(yīng)相關(guān)酶富積相關(guān)的基因的豐富度也與食肉動(dòng)物類似。更重要的是，對(duì)大熊貓糞便樣品的酶活性分析顯示其纖維素酶和木聚糖酶和其它植食性動(dòng)物相比處于最低水平。

總之，所有這些結(jié)果都揭示大熊貓腸道菌群并沒有產(chǎn)生消化竹子中纖維素和半纖維素的特化。

背景

大熊貓是高度易危的物種，也是野生動(dòng)物保護(hù)中廣受世界關(guān)注的旗艦種類。從系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系來看，大熊貓隸屬于熊科，這一類群同時(shí)包括肉食性和雜食性的物種。大熊貓最神奇之處在于它每天消耗大量富含纖維素的竹子，但是它卻生就典型的食肉類動(dòng)物短而簡(jiǎn)單的胃和腸道消化系統(tǒng)。此外，伴隨全球氣候變化的威脅，這一物種因?yàn)閺?qiáng)烈地依賴于大量取食少數(shù)幾種竹子而面臨滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。

研究者們已試圖從各個(gè)不同方面探討大熊貓的適應(yīng)性演化與未來生存境況。例如： 基于頭骨解剖學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)其頭骨強(qiáng)健且骨縫強(qiáng)烈愈合、下頜骨發(fā)達(dá)、咬肌強(qiáng)壯、臼齒平展。此外，它還進(jìn)化出“假拇指”，這有助于提高取食效率。隨著季節(jié)的變化，大熊貓取食的竹子種類和部位都會(huì)產(chǎn)生變化，以獲取更多的能量。還有研究顯示Tas1r1（鮮味受體基因）假基因化可能與其食性的轉(zhuǎn)變有關(guān)，這一事件發(fā)生在4.2個(gè)百萬年左右。然而，其它的因子可能也參與了其食性轉(zhuǎn)變的調(diào)控，如同為植食性的馬和奶牛就保持了完整的鮮味受體基因。

此外，大熊貓基因組中的“食欲獎(jiǎng)賞系統(tǒng)”中不完善的多巴胺代謝被認(rèn)為是導(dǎo)致其食性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子。盡管關(guān)于大熊貓食性轉(zhuǎn)變的后果已經(jīng)有大量突出的研究成果，然而為什么大熊貓要轉(zhuǎn)變?yōu)槌灾褡樱窟@一問題依然還是未解之謎。 此外，大熊貓沒有發(fā)育出其它植食性哺乳動(dòng)物那樣發(fā)達(dá)的瘤胃或盲腸，它取食大量富含纖維素的竹子，與同等體型的植食性動(dòng)物相比，它們?nèi)绾我蕾囘@樣的食物而存活依然未知。然而，值得關(guān)注的是，對(duì)大熊貓基因組的研究揭示它們擁有肉食動(dòng)物消化系統(tǒng)中所有的關(guān)鍵性酶，但是卻缺乏消化富含纖維素的酶類。在這種情況下，它不得不依賴胃腸道微生物菌群以適應(yīng)于高纖維含量的飲食。季節(jié)性的食物來源轉(zhuǎn)變會(huì)改變大熊貓的胃腸道微生物菌群組成，也給其自身健康帶來問題，引起發(fā)炎等癥狀。慢性胃腸道紊亂會(huì)導(dǎo)致圈養(yǎng)大熊貓排泄粘性糞便。胃腸道疾病也是引起野生或者圈養(yǎng)大熊貓死亡的主要疾病。胃腸道系統(tǒng)中與淋巴組織關(guān)系密切的微生物能夠驅(qū)除病原體，協(xié)助產(chǎn)生短鏈脂肪酸以增強(qiáng)對(duì)抗病原體的屏障。因此，對(duì)大熊貓腸道菌群開展研究對(duì)于掌握影響其營養(yǎng)與健康的重要生物學(xué)機(jī)制意義重大。

Ley等(2008)人的研究發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道菌群的組成與熊類似，而與其它哺乳動(dòng)物顯著不同。Li等（2015）基于腸道菌群16S rDNA的分析，發(fā)現(xiàn)雖然大熊貓與小熊貓一樣取食竹子，但是其腸道菌群的組成與黑熊更相似。Xue等(2015)對(duì)45只圈養(yǎng)大熊貓的研究也揭示艾希氏桿菌（Escherichia）、志賀氏菌（shigella）和鏈球菌（Streptococcus）是其腸道系統(tǒng)菌群中的關(guān)鍵組成。這些類群同樣出現(xiàn)在包含熊在內(nèi)的食肉動(dòng)物的消化系統(tǒng)中。該研究還指出大熊貓腸道系統(tǒng)并沒有進(jìn)化出能有效地消化富含纖維素的腸道菌群。Fang等人(2012)的研究發(fā)現(xiàn)大熊貓的腸道菌群可能有助于消化木質(zhì)素，但是這項(xiàng)研究所用樣品數(shù)量較為有限，也沒有提供能夠證明其腸道菌群具有消化木質(zhì)素能力的直接證據(jù)。如果僅考慮菌群的組成，而沒有研究其生物學(xué)功能較難得出可靠的結(jié)論(Wei, et al. 2015)。宏基因組學(xué)的研究手段為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了可能。

為了探討上述科學(xué)問題，研究者對(duì)73組（14組為新測(cè)數(shù)據(jù)）來源于不同食性哺乳動(dòng)物糞便樣品的宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)大熊貓胃腸道菌群中與纖維素和半纖維素消化、氨基酸降解和生物合成通路相關(guān)的基因的相對(duì)豐富度與熊非常近似。此外，與別的植食動(dòng)物相比，大熊貓糞便樣品中纖維素酶和半纖維酶的活性最低。此項(xiàng)研究為大熊貓胃腸道菌群沒有特化出消化纖維素和半纖維素的能力提供了直接證據(jù)。

研究方法

用于宏基因組測(cè)序的樣品來源于圈養(yǎng)動(dòng)物，包括6只大熊貓、4只亞洲黑熊、4只竹鼠的糞便樣品。 用于酶學(xué)活性分析的樣品除了大熊貓，還有65只其它動(dòng)物的新鮮糞便樣品，包括家兔、山羊、馬、奶牛、小鼠、長頸鹿、斑馬、盤羊、梅花鹿、老虎、狼、獅子和狒狒。

宏基因組測(cè)序由諾和致源完成，采用Illumina HiSeq 2500雙端測(cè)序策略。原始數(shù)據(jù)使用cutadapt 1.3去除接頭序列。數(shù)據(jù)中竹子的序列參考毛竹的基因組使用BWA比對(duì)去除；大熊貓和亞洲黑熊的序列參考大熊貓已發(fā)表基因組去除；竹鼠糞便樣品中宿主的序列參考大鼠的基因組序列去除。去除接頭和宿主后的數(shù)據(jù)使用FLASH進(jìn)行組裝。Sanders 等(2015)發(fā)表的數(shù)據(jù)也包含在分析中。為了避免不同的測(cè)序深度造成的偏差，使用seqtk-master對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)抽提，以獲得140869條序列進(jìn)行后續(xù)分析。使用MetaGeneMark進(jìn)行序列開放閱讀框的預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)的氨基酸序列使用KEGG在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋。碳水化合物活性酶的注釋使用 CAZYmes分析工具箱。

非真核生物KEGG直系同源基因和碳水化合物活性酶家族基因的相對(duì)豐富度通過將每個(gè)樣品中所有KO和碳水化合物活性酶家族序列數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為1。含KOs相對(duì)豐富度信息的觀察矩陣表使用非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA） 計(jì)算樣品之間的歐式距離，并使用主坐標(biāo)分析法（Principal Coordinates Analysis，PCoA）對(duì)樣品之間的差距進(jìn)行定量和圖示。這些分析在PAST v.3.1中完成，以對(duì)比大熊貓和其它動(dòng)物纖維素、半纖維素降解相關(guān)的纖維素酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶這些功能相關(guān)基因的相對(duì)富集度。為了研究不同哺乳動(dòng)物腸道菌群中纖維降解相關(guān)基因的β-多樣性，使用了距離分析和PCoA排序?qū)Ρ?。由于各個(gè)物種取樣數(shù)量不等，所以使用了曼特惠尼檢驗(yàn)（Mann Whitney test）進(jìn)行差異顯著性分析。

前人研究顯示植食動(dòng)物和肉食動(dòng)物的中丙酮酸和谷氨酸代謝通路顯著不同，本研究手工繪制了相關(guān)基因富集程度的差異。碳水化合物活性酶相關(guān)基因的UPGMA聚類樹使用不同來源樣品中這一基因家族的相對(duì)豐富度繪制，并使用自舉檢驗(yàn)對(duì)節(jié)點(diǎn)的支持率進(jìn)行計(jì)算。使用LEfSe分析檢測(cè)不同食性類群之間菌群組成的差異。不同類群間差異是否顯著使用GraphPad Prism 5 軟件中的曼特惠尼檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

通過分析糞便樣品的纖維素酶和木聚糖酶的活性對(duì)大熊貓、食肉動(dòng)物、食草動(dòng)物和雜食動(dòng)物腸道菌群的纖維素降解力進(jìn)行對(duì)比。纖維素酶和木聚糖酶是纖維素和半纖維素降解通路中最關(guān)鍵的酶類。使用纖維素酶蒽酮比色法和中性木聚糖酶二硝基水楊酸法分別對(duì)這兩種酶的活性進(jìn)行定量檢測(cè)。使用曼特惠尼檢驗(yàn)分析大熊貓與不同食性樣品組之間的差異是否顯著。

研究結(jié)果

PCoA顯示大熊貓腸道菌群宏基因組功能預(yù)測(cè)結(jié)果與熊和別的食肉動(dòng)物更為近似（圖1）。從歐式距離的UPGMA聚類樹來看大熊貓與其它植食動(dòng)物的差距也顯著大于（P<0.001）其與其它食肉動(dòng)物之間的差距（圖3.>

圖1. 大熊貓腸道微生物菌群功能組成與熊和其它食肉動(dòng)物類似

前人研究顯示腸道菌群中有4個(gè)基因與纖維素和半纖維素的降解密切相關(guān)，這些基因也同樣出現(xiàn)在大熊貓的胃腸道菌群中（圖1. B-E）。分析發(fā)現(xiàn)，這些基因同樣也出現(xiàn)在本研究包含的所有食性類型的動(dòng)物類群中。然而，它們?cè)诖笮茇埬c道菌群中的相對(duì)豐富度卻顯著低于（P<>

Muegge等人(2011)的研究顯示植食性哺乳動(dòng)物的腸道菌群中與氨基酸生物合成反應(yīng)相關(guān)的酶得到富集，而肉食性哺乳動(dòng)物的腸道菌群中與氨基酸降解反應(yīng)相關(guān)的酶得到富集。此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道菌群中與氨基酸降解通路密切相關(guān)的酶得到了富集，而與氨基酸合成通路密切相關(guān)的酶則較為缺乏，與肉食性哺乳動(dòng)物非常類似。此外，大熊貓腸道菌群中催化谷氨酰胺和谷氨酸降解的基因也相對(duì)較為豐富，相反催化這些物質(zhì)合成的基因則較為不足 (圖2)。

圖2. 丙酮酸和谷氨酸代謝通路及其催化基因相對(duì)豐度在大熊貓、熊、肉食者、雜食者和植食者之間的對(duì)比

植食性動(dòng)物的發(fā)酵代謝，包括前腸發(fā)酵和后腸發(fā)酵被認(rèn)為在其食用低能量的植物資源中具有重要的作用。此研究還比較了不同食性類型腸道菌群中催化短鏈脂肪酸產(chǎn)生和利用相關(guān)酶編碼基因的相對(duì)豐富度。同樣，大熊貓和其它食肉動(dòng)物類似，其能夠代謝丙酸、乙酸、丁酸甲酯相關(guān)酶的豐富度也低于植食動(dòng)物。Wood-Ljungdahl通路和甲烷生成通路相關(guān)酶的豐富度同樣低于其它植食動(dòng)物。因此，此項(xiàng)研究揭示與其它食肉動(dòng)物類似，具有較短且簡(jiǎn)單胃腸消化系統(tǒng)的大熊貓腸道同樣缺乏微生物發(fā)酵的能力。

此外，從碳水化合物活性酶相關(guān)基因的豐富度來看（圖3. B），與纖維素和半纖維素的降解有關(guān)的基因家族在大熊貓腸道菌群中并不豐富，其所占比例與熊和別的食肉動(dòng)物類似。而與其它食肉動(dòng)物相比，8類在大熊貓中較為豐富的CAZY家族沒有1類與纖維素和半纖維素的降解有關(guān)。

圖3. 碳水化合物活性酶相關(guān)基因豐富度在大熊貓和其它植食動(dòng)物間的對(duì)比

以上結(jié)果均揭示大熊貓腸道菌群代謝纖維素和半纖維素的能力低于其它的植食性動(dòng)物。酶學(xué)活性的直接分析也進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果（圖4）。

圖4. 不同食性哺乳動(dòng)物間纖維素酶和半纖維素酶活性的對(duì)比

主要結(jié)論

此項(xiàng)研究為大熊貓腸道菌群是否具有降解纖維素和半纖維素的能力提供了較為可靠的證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)與纖維素和半纖維素降解密切相關(guān)的酶的相對(duì)豐富度在植食性哺乳動(dòng)物中明顯高于大熊貓和食肉動(dòng)物。研究者們推測(cè)，大熊貓具有與其它食肉類動(dòng)物類似的胃腸道結(jié)構(gòu)，在功能上可能還沒有形成類似植食性動(dòng)物的菌群組成，這可能也與其較短的演化歷史有關(guān)，它可能正處于適應(yīng)于高纖維飲食的演化進(jìn)程中。

大熊貓胃腸消化系統(tǒng)缺乏其它植食性動(dòng)物特有的瘤胃或者盲腸等能夠?qū)Ω呃w維食物進(jìn)行發(fā)酵的場(chǎng)所。竹子在其消化系統(tǒng)中停留的時(shí)間相對(duì)較短，這也不利于多糖類物質(zhì)的發(fā)酵。大熊貓取食竹子的過程中獲取到的能量是非常有限的。Zhu 等(2011)的研究揭示大熊貓腸道菌群中纖維素酶和半纖維素酶的相對(duì)豐富度與其它植食性動(dòng)物比較處于較低水平，這一結(jié)果與此項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)也是一致的。

從野生動(dòng)物保護(hù)的角度來看，已有研究報(bào)道大熊貓分布范圍不斷縮減，伴隨氣候變化帶來的種群片段化不斷加劇，尤其是近兩個(gè)世紀(jì)以來，其棲息地喪失和片段化的情況更加嚴(yán)峻。然而，它的消化系統(tǒng)并沒有演化出有效地消化竹子的能力，因而強(qiáng)烈地依賴于大量取食竹子。目前，除了大熊貓的保護(hù)，竹林的保護(hù)已經(jīng)變得至關(guān)重要。

主要參考文獻(xiàn)

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