慢性乙型病毒性肝炎影響著全球超過 2.5 億人口，每年約有 65 萬人死于 HBV 相關(guān)終末期肝病。共價(jià)閉合環(huán)狀（ccc）DNA 是慢性乙肝持續(xù)感染的元兇，作為病毒復(fù)制的中介，其在宿主肝細(xì)胞核內(nèi)以微染色體的形式存在，目前的治療手段難以將其徹底清除，從而達(dá)到慢性乙肝的徹底治愈。

Gut 雜志上發(fā)表了德國弗萊堡大學(xué)醫(yī)院 Nassal 教授的一篇綜述，該文概述了 cccDNA 的研究歷史、目前研究中存在的困難、近期的研究進(jìn)展以及與之相關(guān)的治療策略。

人 HBV 是嗜肝 DNA 病毒的原型，同屬哺乳動物的正嗜肝 DNA 病毒還有旱獺肝炎病毒（WHV）、地松鼠肝炎病毒（GSHV）、毛猴乙型肝炎病毒（WMHBV）等，此外還有水禽類嗜肝 DNA 病毒，如鴨乙型肝炎病毒（DHBV）、鷺乙型肝炎病毒（HHBV）。

如圖 1A 所示，HBV 病毒，或稱「Dane 顆?！梗珊?3 種外膜蛋白（血清學(xué)上的 HBsAg）的包膜包裹核衣殼（血清學(xué)上的 HBcAg）構(gòu)成。核衣殼內(nèi)包含的病毒基因組是一個(gè)部分雙鏈的松弛環(huán)狀 DNA，即 RC-DNA。HBV 基因組最顯著的特征在于其結(jié)構(gòu)緊密，功能齊全（圖 1B）。HBV 基因組的開放閱讀框（ORF）存在重合，一個(gè) ORF 可轉(zhuǎn)錄 2 種 mRNA，編碼 2 種蛋白，所有基因表達(dá)和復(fù)制所必須的調(diào)節(jié)原件都埋在基因序列中。

圖1. HBV 的基本分子特征。
圖A為病毒結(jié)構(gòu)；圖B為基因構(gòu)成（綠色箭頭：啟動子；EnHⅠ/EnH‖：轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子；DR1，DR2：直接重復(fù)序列；紅色波浪線：正鏈DNA上的RNA引物）

如圖 2 所示，HBV 感染肝細(xì)胞始于病毒顆粒表面 L 蛋白被肝細(xì)胞表面鈉 - 牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）受體識別并結(jié)合，可能以內(nèi)吞形式進(jìn)入細(xì)胞。在胞漿中釋放出核衣殼，核衣殼在核心蛋白核定位信號的作用下，進(jìn)入胞核，并釋放出 RC-DNA，并最終形成 cccDNA。

cccDNA 與核小體結(jié)合形成獨(dú)立于細(xì)胞染色體外的微小染色體結(jié)構(gòu)，這一過程有賴于 HBx 和核心蛋白的參與。

cccDNA 是病毒轉(zhuǎn)錄的模板，其利用宿主細(xì)胞的 RNA 聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可產(chǎn)生 3 種亞基因組 RNA，用于合成病毒蛋白，以及 2 種長于基因組的 RNA，用于病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)譯核殼等。有效的 cccDNA 轉(zhuǎn)錄受到肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子及 HBx 的調(diào)控。

在細(xì)胞漿中，pgRNA 和病毒 P 蛋白一起被新形成的核殼蛋白包裹，在此以 pgRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成負(fù)鏈，隨后 pgRNA 降解，正鏈合成，新的 RC-DNA 形成。含有 RC-DNA 的成熟核心顆粒包裹外膜蛋白，在細(xì)胞多泡體的參與下分泌出細(xì)胞，此外，新生的成熟核心顆粒還可以再次入核，擴(kuò)充細(xì)胞的 cccDNA 池。

圖2.  肝細(xì)胞中HBV的生命周期
（GVG：粘多糖；NTCP：鈉 - ?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽）

由上述 HBV 感染的生命周期可見，cccDNA 是 HBV 在肝內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的模板，是建立有效感染的基礎(chǔ)。然而，由于 HBV 的宿主范圍極窄，目前僅有少量、復(fù)雜的體外感染系統(tǒng)可用于研究 cccDNA。

使用相應(yīng)宿主的原代肝細(xì)胞是解決這一難題的策略之一，但人的肝細(xì)胞獲得困難，替代動物樹鼩飼養(yǎng)要求高，價(jià)格昂貴。此外原代肝細(xì)胞存在最主要的問題在于伴隨著NTCP表達(dá)的逐漸缺失，其對HBV的易感性也很快下降。長期HBV易感性可通過向免疫缺陷小鼠移植人或者樹鼩的肝細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，但技術(shù)非常復(fù)雜。

NTCP 作為 HBV 受體這一發(fā)現(xiàn)為 cccDNA 的研究提供了極大便利，通過表達(dá) NTCP 受體，實(shí)驗(yàn)中常用的 HepG2、Hu7 等細(xì)胞系均可被HBV 感染，但要獲得高感染率仍需在培養(yǎng)體系中加入相當(dāng)高劑量的病毒顆粒（細(xì)胞數(shù)量的 10E4 倍）來實(shí)現(xiàn)。

研究 HBV 的非感染模型，向細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HBV 質(zhì)粒或尾靜脈高壓注射 HBV 質(zhì)粒等，cccDNA 形成均很少甚至沒有。在這些模型中，質(zhì)粒替代cccDNA 成為病毒復(fù)制的主要模板。與之類似的還有 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠，其 HBV 基因是整合在小鼠基因組中的。

不同于 HBV，DHBV 在不同的體系中很容易檢測到 cccDNA，而鴨肝細(xì)胞也相對容易獲得，體內(nèi)試驗(yàn)較為便利。

鴨肝病毒模型闡明了 cccDNA 在肝炎病毒復(fù)制周期和持續(xù)感染中的重要作用，主要研究結(jié)果包括：cccDNA 的形成有賴于逆轉(zhuǎn)錄，而非 DNA 的半保留復(fù)制；cccDNA 在細(xì)胞核內(nèi)以 cccDNA 池的形式存在，每個(gè)細(xì)胞核中往往不止 1 個(gè)拷貝；檢測單個(gè)細(xì)胞核內(nèi) cccDNA 的技術(shù)。

近期有研究利用攜帶一種包膜缺陷 DHBV 病毒的肝細(xì)胞系，如 DStet5，包膜蛋白缺陷導(dǎo)致病毒分泌受阻，因此可誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞內(nèi) cccDNA 水平大幅增加（如圖 3），這種 DHBV 在人的肝癌細(xì)胞系內(nèi)也可達(dá)到很高的 cccDNA 水平，從而為 cccDNA 的研究提供了便利。

由于 cccDNA 呈超螺旋結(jié)構(gòu)，相比與同等長度的 RC-DNA，其具有更高的電泳遷移率，因此 cccDNA 可通過 Southern blot 與其他形式的肝病毒基因組進(jìn)行鑒別。

圖3. Southern blot 檢測 cccDNA

慢性感染鴨肝炎模型顯示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)平均含有 10 拷貝左右的 cccDNA，不同細(xì)胞間拷貝數(shù)變化很大，且隨著感染的病程具有時(shí)間上的波動。

人慢乙肝單個(gè)肝細(xì)胞拷貝數(shù)似乎更低（平均 0.1-1 拷貝 / 細(xì)胞），而 Southern blot 檢測下限約為 10 拷貝 / 細(xì)胞，因此如此低的 cccDNA 水平使得 Southern blot 難以準(zhǔn)確的檢測到單個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)。

所有基于 PCR 的檢測方法，如引物設(shè)計(jì)在 RC-DNA 正鏈缺失段兩端的「over-gap」PCR，或以環(huán)狀 DNA 為模板的滾環(huán)擴(kuò)增，但不能絕對排除 RC-DNA 的干擾。另有非 PCR 的侵入分析技術(shù)，利用一條引物與 cccDNA 形成 3 鏈結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)可被特異性的核酸內(nèi)切酶識別。

總之，最大化 cccDNA 的選擇性，排除 RC-DNA 干擾是準(zhǔn)確定量 cccDNA 的關(guān)鍵，只對胞核而非全細(xì)胞進(jìn)行檢測，并聯(lián)合外源性核酸酶特異性降解 RC-DNA 或?yàn)橐环N解決策略。另外應(yīng)注意單鏈上的一個(gè)缺口即可造成雙鏈解螺旋，導(dǎo)致低估 cccDNA 載量。

對研究者而言，應(yīng)當(dāng)清楚每一種方法的缺陷，并亟需建立一種標(biāo)準(zhǔn)的高敏感性的檢測方法。對讀者而言，應(yīng)清楚的認(rèn)識到，對于已經(jīng)處于很低水平的 HBV cccDNA，宣稱進(jìn)一步降低其載量的數(shù)據(jù)支持或并不充分。

侵入肝細(xì)胞的 RC-DNA 是 cccDNA 形成的直接前體，由 RC-DNA 形成 cccDNA 稱為「從頭合成」，這一過程需要去除負(fù)鏈 5』端的末端 P 蛋白和 3』端的末端過剩段（r），兩端連接成環(huán)，同時(shí)正鏈的 5』端去除 RNA 引物，3』進(jìn)行延長，兩端閉合。

在 cccDNA 從頭合成過程中，病毒 P 蛋白有部分參與，但宿主 DNA 修復(fù)系統(tǒng)在其中發(fā)揮了重要作用，主要參與的酶有核酸內(nèi)切酶、酪氨酰磷酸二酯酶、DNA 聚合酶、多核苷酸激酶或磷酸酶、DNA 連接酶等（如圖 4）。

圖4. RC-DNA 的結(jié)構(gòu)特征

核苷類藥物停藥或免疫抑制狀態(tài)下病毒反彈提示 cccDNA 可持續(xù)存在長達(dá)數(shù)十年，但目前尚沒有人類 cccDNA 消減動力學(xué)數(shù)據(jù)。土撥鼠和鴨肝感染模型提示 cccDNA 的半衰期為 33 和 57 天。黑猩猩急性感染時(shí)，cccDNA 半衰期縮短至 3 天，但仍有痕量 cccDNA 可持續(xù)數(shù)年。

在慢性感染中，新的 cccDNA 的產(chǎn)生與已存在 cccDNA 的消失受到眾多因素影響，二者的綜合結(jié)果決定了 cccDNA 池的大小。當(dāng)前，我們?nèi)詿o法確切知道單個(gè) cccDNA 分子的生命周期。

1. cccDNA 的生命周期取決于單個(gè)分子，還是存在 cccDNA 的更新？如果存在更新，那么是經(jīng)過何種途徑？（細(xì)胞內(nèi)？細(xì)胞間？或細(xì)胞外？）其動力學(xué)特征如何？
   

2. 在急性自限性 HBV 感染中，cccDNA 是如何被清除的？
   

3. 如果細(xì)胞可以從 cccDNA 的層面獲得免疫學(xué)治愈，那其具體機(jī)制如何？
   

4. cccDNA 在細(xì)胞分裂過程中是否存活？如何存活？
   

5. 什么因素限制了 cccDNA 在大多數(shù)人的肝癌細(xì)胞系及鼠肝細(xì)胞的形成和積累？
   

6. 為什么這種限制在鴨 HBV 并不明顯，甚至是感染人的細(xì)胞？
   

7. 何種機(jī)制限制了 cccDNA 的無限擴(kuò)增，這種機(jī)制可用于減少 cccDNA 的拷貝數(shù)么？
   
   

以 cccDNA 作為治療靶點(diǎn)，首先需要闡明 cccDNA 的生命周期取決于單個(gè)分子的生命期還是通過更新維持 cccDNA 池。若沒有 cccDNA 的更新，那么阻斷 RC-DNA 向 cccDNA 轉(zhuǎn)變僅在感染之初有效。

在人源化小鼠模型上，低劑量 HBV 感染后予以 NTCP 受體阻斷劑 Myrcludex B 治療，不僅可以阻止病毒播散，還可使已感染細(xì)胞 RC-DNA 向 cccDNA 的轉(zhuǎn)變過程受損。這一結(jié)果上需要在臨床研究中加以確認(rèn)。

第二個(gè)可能的靶點(diǎn)是宿主 DNA 修復(fù)系統(tǒng)。然而，宿主 DNA 修復(fù)系統(tǒng)繁雜龐大，且存在代償機(jī)制，阻斷其中某條通絡(luò)或并不能阻斷 cccDNA 的形成，而大范圍阻斷將影響到細(xì)胞本身的 DNA 修復(fù)。

另一個(gè)替代策略是阻斷 RC-DNA 前體入核，RC-DNA 的核轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于核衣殼，靶向核衣殼的藥物正在研發(fā)當(dāng)中。

誘導(dǎo)組裝空的核衣殼或不規(guī)則的聚合物，將破壞核衣殼的穩(wěn)定性，它們或在胞漿中解體，RC-DNA 釋入胞漿，不僅無法達(dá)到胞核，反被胞漿 DNA 感受器識別，誘導(dǎo) 1 型干擾素的產(chǎn)生。

需要再次強(qiáng)調(diào)的是，減少已有的 cccDNA，需要以 cccDNA 池通過更新維持其數(shù)量為前提。

cccDNA 的轉(zhuǎn)錄受到外部調(diào)控，靶向這些細(xì)胞調(diào)控機(jī)制或達(dá)到 cccDNA 功能性失活。這類選擇包括干擾素α、靶向 HBx 的藥物，以及 DNA 損傷結(jié)合蛋白 DDB1。

然而功能性失活 cccDNA 的局限在于在 cccDNA 存續(xù)期間需要持續(xù)干預(yù)。此外，轉(zhuǎn)染無轉(zhuǎn)錄活性 cccDNA 的細(xì)胞對免疫介導(dǎo)的 cccDNA 清除更加穩(wěn)定。因此這一觀點(diǎn)需要更多的研究加以證實(shí)。

肝細(xì)胞內(nèi) cccDNA 池的穩(wěn)態(tài)取決于 cccDNA 消長的速度。由于 cccDNA 更新動力學(xué)尚不明確，清除已有的 cccDNA 似乎是更加直截了當(dāng)?shù)倪x擇。在慢性感染條件下，清除已有 cccDNA 有兩種策略，一是免疫介導(dǎo)的 cccDNA 的清除，二是設(shè)計(jì)核酸酶對基因進(jìn)行編輯。

天然免疫和適應(yīng)性免疫在清除急性 HBV 感染時(shí)發(fā)揮重要作用，慢性 HBV 感染存在免疫應(yīng)答的不足，重新建立有效的免疫應(yīng)答意義重大。

免疫介導(dǎo)的 cccDNA 清除包括兩個(gè)層面：一是從肝細(xì)胞內(nèi)清除 cccDNA，即非溶細(xì)胞式清除；二是由殺傷性 T 細(xì)胞破壞含有 cccDNA 的肝細(xì)胞。兩種機(jī)制在急慢性 HBV 感染時(shí)都存在，但各自的相對貢獻(xiàn)尚不清楚。

近期一項(xiàng)研究提示非常高劑量的干擾素 -α，或有效激活淋巴毒素 -β受體可直接靶向作用于 cccDNA 的完整性，經(jīng) APOBEC3A 和 B 介導(dǎo)負(fù)鏈去氨基作用，并最終降解 cccDNA。

盡管在某些方面存在爭議，Toll 樣受體 7 激動劑 GS-9620 的臨床前試驗(yàn)結(jié)果充滿希望，肯定了激活天然免疫應(yīng)答的治療價(jià)值。

在不同免疫介導(dǎo)的 cccDNA 下降過程中，一部分 cccDNA 似乎相當(dāng)頑固，難以進(jìn)一步降低。這或許是含有 cccDNA 細(xì)胞本身的特質(zhì)，也有可能是 cccDNA 存在更難以被分解的形式，例如甲基化、染色體化等。

利用核酸酶進(jìn)行基因編輯的技術(shù)進(jìn)步催生了靶向 cccDNA 的新工具，例如鋅指核酸內(nèi)切酶、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶、以及 RNA 引導(dǎo)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 (CRISPR) 基因組編輯技術(shù)。

這類新技術(shù)仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如不能特異性靶向含有 cccDNA 的肝細(xì)胞，線性病毒 DNA 整合到肝細(xì)胞基因組，以及 DNA 修復(fù)系統(tǒng)可能再次生成完整的 cccDNA 等。此外，細(xì)胞內(nèi)過量的 RC-DNA 是否會影響到藥物準(zhǔn)確靶向 cccDNA 并不清楚。

因此，發(fā)展其他新技術(shù)，包括治療性疫苗、反義寡核苷酸和基于 RNA 干擾等，仍具有廣闊的空間。

圖5. 靶向 cccDNA 的潛在治療策略

cccDNA 在 HBV 持續(xù)感染中的作用毋庸置疑，治愈慢性乙肝將必須攻克這一難題。

目前，受限于體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷木窒?，?cccDNA 的形成、降解等生物學(xué)特性的認(rèn)識仍存在許多空白，隨著細(xì)胞感染系統(tǒng)和小動物模型的建立，這些問題有望在不遠(yuǎn)的未來得以解答。徹底消除 cccDNA，僅依靠一種策略可能難以實(shí)現(xiàn)，聯(lián)合對 cccDNA 生化特征的認(rèn)識、機(jī)體在急性感染時(shí)免疫系統(tǒng)清除 cccDNA 的方式以及操縱編輯 DNA 的新技術(shù)，或有望實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

希望終有一天，慢乙肝可以像慢丙肝一樣被治愈。

最后，小編要隆重登場了：

噔噔蹬等！

我就是小碼哥，

小碼哥就是我↓

如果你對基因相關(guān)話題感興趣

或者對小碼哥本人感興趣