RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。

RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。

RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。

Real-time-PCR和 qPCR（Quantitative Real-time-PCR）是一碼事，都是實(shí)時(shí)定量PCR，指的是PCR過(guò)程中每個(gè)循環(huán)都有數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)記錄，因此可以對(duì)起始模板數(shù)量進(jìn)行精確的分析。

RT-qPCR（Real-time Quantitative PCR），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 就是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模版進(jìn)行定量分析的方法。

一般分為兩類，一類為染料類，包括如SYBR Green I、Eva Green等，通過(guò)熒光染料來(lái)指示產(chǎn)物的增加；一類為探針類，包括TaqMan探針和分子信標(biāo)探針等，利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。

SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)，這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。SYBRGreen I的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm ，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，體系中的SYBR Green熒光染料摻入DNA雙鏈后發(fā)射出熒光，并且熒光的強(qiáng)度與體系中雙鏈的濃度成正比，從而保證了熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，熒光的強(qiáng)度就代表了體系中雙鏈產(chǎn)物的濃度。

優(yōu)點(diǎn)：成本低，不需要探針；準(zhǔn)備時(shí)間和實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單；可以制作熔解曲線來(lái)確定PCR產(chǎn)物是否特異、有無(wú)引物二聚體。

缺點(diǎn)：無(wú)法多重檢測(cè)，只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)基因；無(wú)模板特異性，只能給出總信號(hào)，對(duì)引物的特異性要求較高；靈敏度低，目的片段需在5000拷貝以上。

應(yīng)用：一般應(yīng)用于相對(duì)定量分析。最適合初步篩查，即先用SYBR Green方法篩查，得到初步結(jié)果后再用TaqMan精確定量

原理為PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，不會(huì)檢測(cè)到熒光；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，也同樣實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

優(yōu)點(diǎn)：特異性高，探針提供了額外的特異性；準(zhǔn)確性高，可給出特異模板的熒光信號(hào)；可應(yīng)用于多重定量。

缺點(diǎn)：成本較高，合成探針費(fèi)用較貴，等待時(shí)間長(zhǎng)。

應(yīng)用：一般應(yīng)用于絕對(duì)定量分析，MGB探針等可應(yīng)用于SNP的檢測(cè)。

基本原理：被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。

優(yōu)勢(shì)：①安全、快速、靈敏度高；②探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；③多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；④可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；⑤可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。

應(yīng)用：① 已知基因或序列的染色體定位；② 未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。

 cDNA 末端快速擴(kuò)增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)【參考文獻(xiàn)：Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE).pdf】

RACE技術(shù)是一種基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來(lái)的、以部分的已知區(qū)域序列為起點(diǎn),擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域,從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長(zhǎng)cDNA5’和cDNA3’末端，進(jìn)而獲得獲得全長(zhǎng)cDNA簡(jiǎn)單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點(diǎn),可同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此近年來(lái)RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫(kù)篩選技術(shù),成為克隆全長(zhǎng)cDNA序列的常用手段。

RACE 是采用PCR 技術(shù)由已知的部分cDNA 順序來(lái)擴(kuò)增出完整cDNA5’和3’末端,是一種簡(jiǎn)便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR (anchoredPCR)和單邊PCR(one2side PCR)。

利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核營(yíng)酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA.然后用一個(gè)基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3' 末端的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)。

先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的5'末端時(shí)自動(dòng)加上3-5個(gè)（dC）殘基，退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭（見(jiàn)Figure 2 ）。然后用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個(gè)基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因5'末端的cDNA片段擴(kuò)增出來(lái)。最終，從2個(gè)有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA，或者通過(guò)分析RACE產(chǎn)物的3'和5'端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA。

RNA pull down（鑒定與目的lncRNA結(jié)合的蛋白配體） 技術(shù)是檢測(cè) RNA 結(jié)合蛋白與其靶 RNA 之間相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。利用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素 RNA 探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過(guò) Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的 RNA 結(jié)合蛋白是否與 RNA 相互作用。

賽默飛世爾推出的Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit試劑盒原理圖

試劑盒利用T4 RNA連接酶將單個(gè)脫硫生物素化的胞苷二磷酸連接到單鏈RNA的3’端。3’端的末端標(biāo)記不干擾RNA結(jié)構(gòu)，因此，比標(biāo)記核苷酸的隨機(jī)摻入更加理想。每個(gè)標(biāo)記反應(yīng)適合50 pmol RNA；不過(guò)，如有必要的話，標(biāo)記反應(yīng)也可擴(kuò)展（從1 pmol到1 nmol）。標(biāo)記反應(yīng)需要20倍過(guò)量的脫硫生物素化核苷酸。對(duì)于不太復(fù)雜的RNA，孵育時(shí)間可為37°C 30分鐘，若是更長(zhǎng)或更復(fù)雜的RNA，時(shí)間也延長(zhǎng)到4-16°C過(guò)夜。通過(guò)改變RNA與核苷酸的比例，延長(zhǎng)孵育時(shí)間，或在標(biāo)記反應(yīng)中添加DMSO，可優(yōu)化復(fù)雜RNA的標(biāo)記效率。

RBP的富集過(guò)程經(jīng)過(guò)優(yōu)化，相當(dāng)簡(jiǎn)單。首先將RNA與鏈霉親和素磁珠結(jié)合。之后在蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合緩沖液中平衡RNA結(jié)合的磁珠，再加入蛋白裂解液。隨后添加適當(dāng)?shù)木彌_液、渦旋振蕩，并在磁力架上分離，洗滌磁珠。最后樣品可通過(guò)非變性的生物素洗脫緩沖液或SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫，用于下游分析（如Western blotting和質(zhì)譜（MS））。

CHIRP-Seq 是一種檢測(cè)與 RNA 綁定的 DNA 和蛋白的高通量測(cè)序方法。采用生物素和鏈霉親和素探針把目標(biāo) RNA 拉下來(lái)后，則與其共同作用的 DNA 染色體片段就會(huì)附在磁珠上，最后把染色體片段做高通量測(cè)序，就會(huì)得到該RNA能夠結(jié)合在基因組的哪些區(qū)域；如果結(jié)合物是蛋白質(zhì)，可以將蛋白質(zhì)打斷成肽段進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

ChIRP( Chromatin Isolation by RNA Purification )，針對(duì)每個(gè)特定的lncRNA分子序列，按照100nt的步長(zhǎng)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為20個(gè)堿基長(zhǎng)度的特異性反義核酸序列，并對(duì)所有序列進(jìn)行編號(hào)，以奇數(shù)為一組，偶數(shù)為一組，合成末端修飾Biotin-TEG基團(tuán)的lncRNA ChIRP probe。lncRNA ChIRP probe與交聯(lián)的lncRNA分子復(fù)合物進(jìn)行特異性雜交結(jié)合，通過(guò)末端修飾Biotin-TEG化學(xué)基團(tuán)，利用鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠進(jìn)行結(jié)合，純化出目標(biāo)lncRNA所結(jié)合的染色質(zhì)復(fù)合體，最后從復(fù)合體中純化出RNA、DNA和蛋白質(zhì)用于后續(xù)的分析，以發(fā)現(xiàn)目標(biāo)lncRNA的分子作用機(jī)制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)：chirp.pdf】

（1）通過(guò) QD-FISH 原位雜交技術(shù)定位；或者通過(guò)細(xì)胞核質(zhì)分離試劑盒得到 RNA，qRT-PCR 檢測(cè)其分布；

（2）全長(zhǎng)序列試驗(yàn)方法：通過(guò) 5′RACE 獲取 lncRNA5′ 全長(zhǎng)， 3′RACE 獲取 lncRNA3′ 全長(zhǎng)，最終得到 lncRNA 完整的全長(zhǎng)序列。

lncRNA 較長(zhǎng)，承載的信息量多，更容易形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，其功能具有多樣化和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。類似于 miRNA，探討 lncRNA 功能可用 gain/loss of function 策略，過(guò)表達(dá)或沉默 lncRNA 后觀察表型。即研究 lncRNA 功能獲得后或者功能缺失后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移與克隆形成，以及病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制等的影響。

（1）功能獲得性研究

構(gòu)建 lncRNA 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或者慢病毒、腺病毒包裝載體。原則上是將全長(zhǎng) lncRNA 定向克隆到表達(dá)載體上實(shí)現(xiàn) lncRNA 的過(guò)表達(dá)。然而有些 lncRNA 很大或全長(zhǎng)尚未分離，這時(shí)將視 lncRNA 在基因組上的定位采取不同的研究策略。在構(gòu)建 lncRNA 表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，需關(guān)注 lncRNA 是否在蛋白編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域或 3′-UTR 區(qū)域，勿遺漏重要區(qū)段。

（2）功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反義核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA，經(jīng) qRT-PCR 或 FISH 等驗(yàn)證后觀察其對(duì)疾病相關(guān)基因表達(dá)和對(duì)細(xì)胞表型等的影響。

lncRNA 可與蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA 相互作用，但是目前最常用的還是利用體外轉(zhuǎn)錄、RNA pull down、RNA-RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）、CHIRP-seq（Chromatin isolation by RNA Purification）、MS 等技術(shù)手段。

將 lncRNA 表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合，解釋其調(diào)控機(jī)理。（1）DNA 甲基化和乙?；嚎赏ㄟ^(guò)檢測(cè)相應(yīng)基因甲基化、乙?；町惻c lncRNA 結(jié)合分析。（2）轉(zhuǎn)錄因子：研究 lncRNA 與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。

有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以繼續(xù)在體內(nèi)或者臨床樣本水平進(jìn)行驗(yàn)證。

lncRNA的作用機(jī)制不清楚，lncRNA 的功能非常難研究。當(dāng)前很多通過(guò)研究 miRNA 與 lncRNA 的調(diào)控關(guān)系來(lái)揭示非編碼 RNA 的功能，最熱門(mén)的要數(shù) ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。相關(guān)的可利用資源包括：

（1）starBase 平臺(tái)構(gòu)建了最全面的 CLIP-Seq 實(shí)驗(yàn)支持的 miRNA 和 lncRNA 的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，包括構(gòu)建了 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 。

（2）DIANA-LncBase 數(shù)據(jù)庫(kù) 只是構(gòu)建了基于單個(gè) CLIP-Seq 數(shù)據(jù)的 miRNA 和 lncRNA 調(diào)控關(guān)系。