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RT-PCR常見問題答疑解惑

 SonGohan 2013-01-11
問 題 可能原因 建議解決方法
RT-PCR靈敏度:在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物
RNA被降解
在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA
使用良好的無污染技術(shù)分離RNA
在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理
在100%甲酰胺中儲(chǔ)存RNA如果使用胎盤RNase抑制劑,不要加熱超過45℃或pH超過8.0,否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT時(shí)加入RNase抑制劑,一定要存在DTT。

RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑
通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70%(v/v)乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行清洗??梢约尤胩窃?.25μg到0.4μg/μl)以幫助小量樣品RNA的恢復(fù)。
逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸鈉,亞精胺,甲酰胺和胍鹽。
將對(duì)照RNA同樣品混合,同對(duì)照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗(yàn)抑制劑。

多糖同RNA共沉淀
使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。
用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火
確定退火溫度適合您的引物。對(duì)于隨機(jī)六聚體,建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。
對(duì)于基因特異性引物(GSP),可以試一下其他GSP,或換用oligo(dT)或隨機(jī)六聚體確定GSP是反義序列。

起始RNA量不夠
增加RNA量。
對(duì)于<50ng的RNA樣品,可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

RNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多
將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火
提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度,對(duì)SuperScriptⅡ可以到50℃,對(duì)ThermoScript可以到65℃。
注意:不要在>60℃時(shí)使用oligo(dT)引物,選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。
對(duì)于>1kb的RT-PCR產(chǎn)物,保持反應(yīng)溫度≤65℃。
注意:不要在高于37℃時(shí)使用M-MLV。
如果不需要全長(zhǎng)cDNA,在第一鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物。

引物或模板對(duì)殘余的RNA模板敏感
在PCR前用RNaseH處理。
靶序列在分析的組織中不表達(dá) 嘗試其他靶序列或組織
PCR沒有起作用 對(duì)兩步法RT-PCR,不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物

PCR靈敏度:在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物
PCR引物設(shè)計(jì)較差 避免在引物3'端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計(jì)Tm類似的引物。
DNA含有抑制劑 諸如DMSO,SDS和甲酰胺之類的試劑會(huì)抑制Taq DNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑,可以使用乙醇沉淀DNA
富含GC的模板 對(duì)于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
模板濃度太低 使用10^4拷貝的靶序列,以在25到30個(gè)循環(huán)中獲得信號(hào)。
鎂離子濃度太低 從1mM到3mM,間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng),確定對(duì)于每個(gè)模板和引物對(duì)的最佳鎂離子濃度。注意:對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR,使用3mM到5mM的鎂離子濃度。
退火溫度太高 使用公式估算Tm,把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5℃。因?yàn)檫@些公式只是估算Tm值,所有真正的退火溫度實(shí)際會(huì)高些或低些。

PCR靈敏度:在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物
引物濃度太低 最佳引物濃度介于0.1μM到0.5μM之間。為了精確確定引物濃度,在260nm測(cè)量光密度,然后使用光吸收值和消光系數(shù)計(jì)算濃度。

RT-PCR特異性:在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預(yù)期條帶
引物和模板非特異性退火 在第一鏈合成中使用GSP,而不是隨機(jī)引物或oligo(dT)。試用允許高溫cDNA合成的GSP。
GSP設(shè)計(jì)較差
RNA中沾染了基因組DNA 使用擴(kuò)增級(jí)DNaseⅠ處理RNA。使用沒有逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)檢測(cè)DNA污染。
形成引物二聚體 設(shè)計(jì)在3'端沒有互補(bǔ)序列的引物。
引物和模板非特異性退火 以2℃到5℃間隔增加退火溫度,減少退火時(shí)間。
在開始幾個(gè)循環(huán)使用較高的退火溫度,然后使用較低的退火溫度。
使用Platinum Taq DNA進(jìn)行自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR。
避免在引物3'端含有2到3個(gè)dG或dC。

鎂離子濃度太高 對(duì)于每一個(gè)模板和引物組合優(yōu)化鎂離子濃度。
因?yàn)閿U(kuò)增復(fù)雜模板導(dǎo)致引物錯(cuò)誤起始 使用巢式PCR或遞減PCR。
沾染外源DNA 使用抗氣霧劑的吸頭和UDG
因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)無法接近 對(duì)于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution。

PCR忠實(shí)性:PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤
聚合酶忠實(shí)性低 使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。
循環(huán)數(shù)太多 降低循環(huán)數(shù)
四種dNTP的濃度不同 制備新的dNTP混合物,保證四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物。

定量RT-PCR無擴(kuò)增產(chǎn)量
相對(duì)熒光信號(hào)小于等于背景或沒有模板對(duì)照

無cDNA合成
cDNA合成溫度太高 降低保溫溫度
反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物被二級(jí)結(jié)構(gòu)封閉 提高保溫溫度。重新設(shè)計(jì)引物
RNA被損害或降解
熒光探針無功能 確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase處理TaqMan探針,校驗(yàn)熒光是否增強(qiáng)。
必要的話設(shè)計(jì)和合成探針。


靈敏度低須在比預(yù)期更高的循環(huán)中檢出產(chǎn)物

初始模板RNA不充分 增加模板RNA的濃度;使用10ng-1μg的總RNA
RNA被損害和降解
必要的話更換RNA
RNAse污染 維持無菌條件;加入RNase抑制劑

無效的cDNA
通過增加70%乙醇清洗的次數(shù)來去除制備RNA過程中的抑制劑
無效的PCR擴(kuò)增
注意:反轉(zhuǎn)錄的抑制劑包括SDS、EDTA、胍鹽、甲酰胺、磷酸鈉和亞精胺
調(diào)整cDNA合成溫度或引物設(shè)計(jì)


信號(hào)高于預(yù)期在低于預(yù)期的循環(huán)中即可檢出產(chǎn)物
反應(yīng)中加的樣品太多 降低模板的濃度
模板或PCR殘余污染 隔離污染來源,更換試劑
使用專用的精致移液器。在無DNA區(qū)域準(zhǔn)備反應(yīng),使用抗氣溶膠的吸頭。


電泳后出現(xiàn)意外的條帶 RNA

被基因組DNA污染 用DNase I預(yù)處理RNA
用于第一鏈合成的寡聚dT或隨機(jī)引物 使用基因特異性引物
PCR的低特異性 優(yōu)化PCR條件

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