|
腸道微生物的組成和變化會影響人體健康的理論已經(jīng)獲得了共識。一些藥物的使用會改變腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而改變?nèi)梭w的生理條件。例如，抗生素的使用顯著影響腸道微生物組成，從而影響人體穩(wěn)態(tài)，可能引起胃腸道副作用或影響其他藥物療效。 中草藥治療是一門臨床實證醫(yī)學(xué)，但其藥理和安全性也頗受質(zhì)疑。在進(jìn)行藥物評估時，藥物對腸道微生物的影響就是一個很重要的指標(biāo)。隨著微生物測序技術(shù)和代謝組檢測技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們能夠用更先進(jìn)和科學(xué)的手段探究中草藥對人體腸道微生物的影響，從這個角度去闡述中草藥對人體健康、疾病治療等方面的作用。 已有諸多研究表明：使用草藥可以特定地改變腸道中豐度較高的菌群結(jié)構(gòu)，例如擬桿菌門、厚壁菌門、AKK菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、普氏菌屬等，這些微生物組成的改變會對很多代謝通路產(chǎn)生影響，例如脂肪酸代謝、糖類代謝、脂質(zhì)代謝等。探究清楚其中的機(jī)制，對中草藥的評估、使用和發(fā)展都有著重要意義。  本次大閱哥將用三個具體的案例來講解如何利用微生物組學(xué)聯(lián)合代謝組學(xué)檢測的方法評價中草藥對腸道微生物的影響并闡述其中的機(jī)制。 案例一：利用16S測序+宏基因組學(xué)探究黃連解毒湯改善高血糖和胰島素抵抗中腸道微生物調(diào)節(jié)的機(jī)制 Chen, M., et al. (2018). Huang-Lian-Jie-Du-Decoction ameliorates hyperglycemia and insulin resistant in association with gut microbiota modulation. Frontiers in Microbiology. (IF：4.019) 藥物：黃連解毒湯 實驗?zāi)Ｐ停?/span>大鼠糞樣 實驗組設(shè)計：對照組(NCG)、模型組(DMG)、治療組(HLJDD) 生物重復(fù)數(shù)：8 主要研究方法：16S、宏基因組(功能預(yù)測的基因驗證) 主要分析手段：LeFSe、PICRUSt 結(jié)論：黃連解毒湯可改善高血糖，恢復(fù)失調(diào)的微生物結(jié)構(gòu)和功能 黃連解毒湯(HLJDD)是一種中藥方劑，臨床應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，其作用機(jī)制已被報道與腸道微生物有關(guān)。然而，還沒有研究發(fā)現(xiàn)HLJDD對2型糖尿病(T2DM)患者腸道微生物的影響。本文探討HLJDD對T2DM患者腸道微生物群的調(diào)節(jié)作用，以及菌群調(diào)節(jié)對疾病治療的可能機(jī)制。 首先，采用16S測序法對正常對照組(NCG)、T2DM模型組(DMG)和HLJDD處理的2型糖尿病組(HLJDD)的大鼠糞便標(biāo)本中的細(xì)菌群落進(jìn)行分析, 并用PICRUSt工具預(yù)測其差異菌種功能。 圖1 差異菌種預(yù)測 A. 三組實驗顯著差異菌種LefSe B.門水平上物種組成比例與豐度(三個處理條件所有樣本) C. 門水平上物種組成比例與豐度(不同處理條件下的實驗分組) 結(jié)果顯示：HLJDD能明顯改善T2DM大鼠的高血糖和炎癥反應(yīng)，恢復(fù)T2DM大鼠失調(diào)的腸道系統(tǒng)；與DMG組相比，HLJDD組具有更多的短鏈脂肪酸和抗炎細(xì)菌產(chǎn)生，如Adlercreutzia、副桿狀菌屬(Parabacteroides)、Blautia 和 Akkemansia菌屬等；與此同時，HLJDD組比DMG組產(chǎn)生更少的條件性致病菌，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)和Facklamia菌屬等。 功能預(yù)測顯示，氨基酸代謝功能在DMG組顯著富集，而治療后，HLJDD組膽汁酸生物合成的代謝上調(diào)且糖酵解/糖異生和核苷酸代謝減少，更偏向于正常對照組，證實大鼠腸道微生物的功能失調(diào)有所恢復(fù)。 圖2 不同實驗組基于PICRUSt預(yù)測菌種功能的ANOVA分析 由于PICRUSt功能預(yù)測只是基于16S DNA片段進(jìn)行的，隨后研究者又用宏基因組的方法驗證了上述基于16S擴(kuò)增子測序得出的功能預(yù)測。宏基因組結(jié)論顯示：這種作用主要通過增加了產(chǎn)短鏈脂肪酸與抗炎癥的細(xì)菌和減少機(jī)會致病菌實現(xiàn)。這與16S DNA片段的研究結(jié)論一致。 此篇文章由中山大學(xué)謝智勇老師團(tuán)隊發(fā)表。首先進(jìn)行16S測序，并基于16S測序結(jié)果用PICRUSt進(jìn)行功能和代謝通路分析，接著用shotgun宏基因組測序驗證預(yù)測得出的功能和通路，是一個不錯的思路。大閱哥想補(bǔ)充一點(diǎn)，既然通路涉及到脂肪酸、膽汁酸和氨基酸等代謝變化，倘若再用靶向代謝組檢測進(jìn)一步驗證，文章將更加完善。 案例二：利用16S測序、GC-MS代謝組檢測等方法探究甘草-甘遂結(jié)合對腸道微生物與其功能的影響研究 Yu, J., et al. (2018). Gancao-Gansui combination impacts gut microbiota diversity and related metabolic functions. Journal of ethnopharmacology. (IF：3.115) DOI：http://dx./10.1016/j.jep.2017.11.031 藥物：甘草、甘遂、甘草-甘遂混合使用 實驗?zāi)Ｐ停?/span>小鼠糞樣 實驗組設(shè)計：對照組(control)、7天連續(xù)服用甘草(GUH)、服用甘遂(EBH)或服用甘草甘遂組合(GEH) 生物重復(fù)數(shù)：6 主要研究方法：16S、GC-MS 主要分析手段：PCoA 、LeFSe、PICRUSt 結(jié)論：甘草-甘遂的結(jié)合使用會對腸道微生物的結(jié)構(gòu)和其對應(yīng)的功能造成不良影響，需要更進(jìn)一步的研究揭示更深機(jī)制 “十八不兼容的藥物”理論(EIM)是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)(中醫(yī))最具代表性的中藥相互作用理論。甘草和甘遂的不兼容就是EIM理論之一。甘草,是最常用的中藥或食品添加劑；甘遂是另一個著名的中藥，通常用于治療水腫、腹水和哮喘,但可能誘發(fā)胃腸道副作用或呼吸道過敏。盡管甘草和甘遂是不兼容的,但他們?nèi)匀辉谥摹案仕?半夏湯(Gansui-Banxia)”中配合使用。 圖3 文章研究思路流程圖 本研究中探究甘草甘遂聯(lián)用是否會加劇由甘遂誘發(fā)的胃腸道損傷。此外,也對甘草甘遂聯(lián)用所影響到腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及相關(guān)代謝通路進(jìn)行了評估、檢測和驗證。 實驗所有小鼠模型被分成四組：對照組、7天連續(xù)服用甘草(GUH)、服用甘遂(EBH)或服用甘草甘遂組合(GEH)。 圖4 四個實驗組的PCoA分析 A.binary Jaccard距離 B.weighted UniFrac距離。 首先，血清生物標(biāo)志物檢測結(jié)果顯示GEH并沒有加劇EBH引發(fā)的胃腸道損傷。接著，對四組小鼠糞便進(jìn)行16S擴(kuò)增子測序，PCoA分析結(jié)果顯示，與對照組相比，GEH比EBH破壞了更多的腸道微生物環(huán)境，而GUH沒有顯著破壞；LefSe分析顯示EBH會導(dǎo)致Mycoplasma和Desulfovibrio菌屬(機(jī)會致病菌)的增加和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)減少。 圖5 三組處理與對照組相比差異菌種LefSe分析
繼續(xù)用PICRUSt工具對16S測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能和代謝通路預(yù)測，結(jié)果顯示，GEH組的碳固定、能量代謝、氨基酸代謝和醌類合成代謝途徑相對減弱，而酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、磷酸戊糖途徑和脂類代謝通路相對升高，而這些變化主要來自于Mycoplasma菌屬豐度的改變。 圖6 基于GC-MS平臺脂質(zhì)代謝組的檢測結(jié)果-膽固醇相對豐度 為了驗證微生物測序得出的代謝通路變化的結(jié)論，考慮到Mycoplasma菌屬在脂質(zhì)代謝方面的主要作用，研究者用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜)來分析小鼠糞便中的脂質(zhì)代謝情況。檢測后共鑒定出三種代謝產(chǎn)物，分別是膽固醇、丁羥甲苯和巖芹酸。結(jié)果顯示GEH組膽固醇豐度最高，而GUH和EBH組膽固醇豐度沒有顯著差異。結(jié)合微生物測序結(jié)果得出結(jié)論，腸道微生物的膽固醇代謝途徑因為GEH的食用失調(diào)，而這應(yīng)是由于Mycoplasma 屬的高豐度導(dǎo)致的。 此篇文章出自南京中醫(yī)藥大學(xué)郭建明和陶偉偉老師課題組，研究了中草藥相互作用對腸道微生物的影響。本研究是探究單一中草藥對腸道微生物影響的另一種研究思路，值得學(xué)習(xí)。先利用16S測序、PICRUSt功能預(yù)測的方法，找到了差異菌種和代謝通路；從中選出顯著差異脂質(zhì)代謝通路，并用GC-MS方法驗證了其代謝產(chǎn)物的差異，最終得出結(jié)論，是一篇經(jīng)典的微生物組測序聯(lián)合靶向代謝組分析的案例。 案例三：利用LC-MS平臺和16S測序研究柳樹皮提取物與腸道細(xì)菌之間的相互作用 Pferschy-Wenzig, et al (2017). A Combined LC-MS Metabolomics-and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in pharmacology, 8, 893.(IF：4.4) 藥物：柳樹皮提取物 實驗?zāi)Ｐ停?/span>人糞便厭氧發(fā)酵培養(yǎng) 實驗組設(shè)計：柳樹皮提取物濃度2mg/ml與10mg/ml，培養(yǎng)時間0.5h、4h與24h，樣本處理分為PMA(在提取DNA之前用PMA處理，以區(qū)分死菌和活菌)和DNA兩組。三個因素排列組合 生物重復(fù)數(shù)：2 主要研究方法：16S測序、LC-MS 主要分析手段：PCA、PCoA、LeFSe、PICRUSt 結(jié)論：利用in vitro培養(yǎng)的方法知曉了柳樹皮提取物中的化學(xué)物質(zhì)和被柳樹皮處理過后的腸道微生物的組成和功能變化 柳樹皮提取物(WBE)是一個沿用千年的中藥材，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱的作用。但是由于其成分復(fù)雜，至今還不能很好地解釋其療效與機(jī)理。本文利用16S測序結(jié)合代謝LC-MS檢測的方法研究了WBE與腸道微生物的相互作用。
圖7 16S測序后不同處理樣本的差異微生物 綠色代表與對照組相比上升，紅色代表下降(圖表部分節(jié)選) 研究首先將取于健康人的糞便與不同濃度的柳樹皮提取物在厭氧條件下分別共同培養(yǎng)0.5、4和24 小時。并對所有不同條件處理的樣本進(jìn)行16S測序，測序結(jié)果顯示與柳樹皮提取物一起培養(yǎng)的糞便中的腸道微生物結(jié)構(gòu)有較大變化，如食物谷菌科(Victivallaceae)、擬桿菌屬(Bacteroides) 和紅蝽菌科(Coriobacteriaceae )等菌種豐度顯著上升，而瘤胃菌科(Ruminococcaceae )，特別是Faecalibacterium prausnitzii菌顯著被抑制。 圖8 基于16S測序數(shù)據(jù)功能預(yù)測差異代謝通路(圖表部分節(jié)選) 通過PICRUSt工具對16S測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能預(yù)測，得出共51條代謝通路在實驗組和對照組中有明顯的差別，特別的是, 擬桿菌屬微生物參與的復(fù)雜碳水化合物和苷類化合物的降解明顯在柳樹皮提取物處理過的糞樣中富集。 圖9 基于LC-MS平臺檢測差異代謝產(chǎn)物(圖表部分節(jié)選) 接著用LC-MS平臺檢測不同實驗組情況，共有58種顯著上升或者下降的代謝產(chǎn)物被注釋出，這些代謝產(chǎn)物在未與WBE共培養(yǎng)的糞樣中是不存在的，說明這些是柳樹皮提取物的成分或者其代謝產(chǎn)物。檢測出的代謝物包括豐度較高的水楊醇衍生物、類黃酮、兒茶素，少量的脂肪族、芳香族酸和芳香醇等物質(zhì)。 最終比對結(jié)果顯示Bacteroides在WBE處理后顯著上升，其中B. uniformis 和 P. distasonis 被報道可以分解類黃酮類化合物，而代謝組檢測到了黃酮甙類，這些菌可能在該代謝通路上發(fā)揮作用。而在WBS處理后上升的食物谷菌科 (Victivallaceae)可能和糖酵解代謝通路有對應(yīng)關(guān)系。 此篇文章出自澳大利亞猶他大學(xué)。本文是在體外研究草藥對腸道微生物影響的一個案例，這種方法非常適合因中藥成分不明確無法在人體上實驗，而又不使用動物模型的場景。研究者利用16S測序和PICRUSt工具進(jìn)行功能預(yù)測，挑選出差異的代謝通路，結(jié)合LC-MS廣篩檢測分析；最終得出部分顯著差異菌種和其所對應(yīng)代謝產(chǎn)物的關(guān)系。本研究是微生物測序和LC-MS平臺聯(lián)用的經(jīng)典案例，值得借鑒。
閱微基因聯(lián)合安隆科訊推出“微生物基因組學(xué)+代謝組學(xué)”聯(lián)合檢測服務(wù)，從物種、基因以及代謝產(chǎn)物等水平為您的研究提供全方位解決方案。 |
|
|
