【原】科研 | Science子刊：以甘氨酸為基礎(chǔ)的治療通過調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、谷胱甘肽合成和腸道微生物群來改善非酒精性脂肪肝

微生態(tài) 2021-04-13

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編譯：yl，編輯：小菌菌、江舜堯。

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導(dǎo)讀

在非酒精性脂肪肝?。?/span>NAFLD）患者中一直有循環(huán)甘氨酸降低的報(bào)道，但關(guān)于甘氨酸降低的原因，其作為致病因素的作用，及其治療潛力仍不清楚。最近，研究人員對(duì)患有NAFLD的人類和小鼠進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)甘氨酸生物合成基因，主要是丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（AGXT1）受到抑制。遺傳（Agxt1^-/-小鼠）和限制甘氨酸供應(yīng)的飲食方法導(dǎo)致飲食誘導(dǎo)的高脂血癥和脂肪性肝炎加重。線粒體/過氧化物酶體脂肪酸β-氧化（FAO）受抑制和炎癥增強(qiáng)也是潛在原因。研究人員使用了具有降脂/降糖雙重特性的甘氨酸類化合物作為非酒精性脂肪肝的潛在療法，并發(fā)現(xiàn)了一種三肽（Gly-Gly-L-Leu，DT-109），它可以在高脂肪、膽固醇和果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中，改善身體成分，降低循環(huán)葡萄糖、血脂、轉(zhuǎn)氨酶、促炎細(xì)胞因子和脂肪性肝炎。

研究人員應(yīng)用元基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)來探索其潛在機(jī)制。Clostridium sensu stricto在NASH小鼠中明顯增加，DT-109治療后減少。DT-109誘導(dǎo)肝臟FAO途徑，降低脂毒性，刺激新生谷胱甘肽合成。反過來，DT-109通過抑制NF-κB靶基因和TGFβ/SMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減弱炎癥浸潤(rùn)和肝纖維化。與其對(duì)腸道微生物組的影響不同，DT-109刺激FAO和谷胱甘肽的合成與NASH無關(guān)。總之，甘氨酸代謝受損可能導(dǎo)致非酒精性脂肪肝。以甘氨酸為基礎(chǔ)的治療通過刺激肝臟FAO和谷胱甘肽的合成來減輕實(shí)驗(yàn)性NAFLD，因此值得未來進(jìn)行臨床評(píng)估。

論文ID

原名：Glycine-based treatment ameliorates NAFLD by modulating fatty acid oxidation, glutathione synthesis, and the gut microbiome

譯名：以甘氨酸為基礎(chǔ)的治療通過調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、谷胱甘肽合成和腸道微生物群來改善非酒精性脂肪肝

期刊：Science Translational Medicine

IF：16.304

發(fā)表時(shí)間：2020.12

通訊作者：Oren Rom

作者單位：密歇根大學(xué)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨著代謝組學(xué)和腸道微生物組學(xué)的進(jìn)展，人們對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)不斷提高，提出了新的治療靶點(diǎn)。人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到NAFLD患者脂類和糖類代謝異常?；诖x組學(xué)的最新研究表明，特定氨基酸的代謝失調(diào)在NAFLD發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用，特別是甘氨酸。NAFLD中大多數(shù)循環(huán)氨基酸的含量增加，但甘氨酸濃度卻降低了，并且與肝脂肪變性（HS）、肝細(xì)胞膨脹和小葉炎癥呈負(fù)相關(guān)。最近將低血漿甘氨酸與已知的生物標(biāo)志物一起用于預(yù)測(cè)NASH。此外，低濃度的循環(huán)甘氨酸與肥胖癥、二型糖尿?。═2D）、代謝綜合征（MetS）、冠心病和心肌梗死等NAFLD合并癥的高患病率有關(guān)，而高濃度的甘氨酸則與肥胖有關(guān)。

非必需氨基酸甘氨酸是由幾種前體在肝臟中合成的。這些反應(yīng)被關(guān)鍵酶催化，這些酶驅(qū)動(dòng)絲氨酸（絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，SHMTs）、蘇氨酸（蘇氨酸脫氫酶，TDH）、肌氨酸膽堿（膽堿脫氫酶和肌氨酸脫氫酶，SARDH）和丙氨酸合成乙醛酸（AGXTs）來形成甘氨酸。甘氨酸用于多種途徑來產(chǎn)生必需分子，包括嘌呤、谷胱甘肽（GSH）、血紅素和肌酸。流行病學(xué)證據(jù)將低水平循環(huán)甘氨酸與心臟代謝疾病性關(guān)聯(lián)，人類或嚙齒動(dòng)物模型中的研究報(bào)告了甘氨酸給藥的降糖/降脂、保護(hù)肝臟或抗炎作用。然而，尚未采用完全模擬人類疾病和準(zhǔn)確劑量的模型對(duì)甘氨酸在NAFLD中的作用進(jìn)行全面研究。

考慮到NAFLD現(xiàn)有治療方法缺乏，而循環(huán)甘氨酸降低與NAFLD嚴(yán)重程度相關(guān)這一現(xiàn)象，使其可能成為一種與新的有效的治療方法。在目前的研究中，我們的目標(biāo)是通過對(duì)患有NAFLD的人和小鼠的肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)，以及通過遺傳和飲食方法限制小鼠的甘氨酸供應(yīng)，來研究甘氨酸代謝改變是否有助于NAFLD的發(fā)展，并進(jìn)一步探討了基于甘氨酸的化合物作為NAFLD的潛在療法及其作用機(jī)理。

結(jié)果

1 人和鼠NAFLD中甘氨酸生物合成受損

為了測(cè)試甘氨酸代謝改變是否有助于NAFLD的發(fā)展，我們首先研究了西方飲食（WD）誘導(dǎo)形成HS的C57BL/6J小鼠。經(jīng)過12周WD飲食，高膽固醇血癥（圖1 A）和HS，經(jīng)蘇木精伊紅（H&E）和油紅O（ORO）染色證實(shí)，肝臟甘油三酯（TGs）和總膽固醇（TC）明顯定量（圖1B至D）。靶向代謝組學(xué)顯示，在所有氨基酸中，血漿甘氨酸降低最顯著（P=0.0111），而其前體絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸升高（圖1 E），顯示甘氨酸生物合成受損?；加蠬S的小鼠肝臟中關(guān)鍵的甘氨酸生物合成基因被下調(diào)，其中Agxt1抑制最顯著（P=0.0002；圖1 F）。此外，棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的TG積累后，HepG2細(xì)胞中的AGXT1明顯下調(diào)（圖1 G和H）。

為了評(píng)估在更嚴(yán)重的NAFLD中是否存在類似的模式，我們對(duì)24周高脂、高膽固醇、高果糖NASH飲食誘導(dǎo)的晚期NASH和纖維化小鼠的肝臟進(jìn)行了RNA測(cè)序（圖1 I）。調(diào)節(jié)氨基酸生物合成的途徑，特別是甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和乙醛酸的代謝，在NASH中受到抑制，包括Agxt1的下調(diào)（P=0.0009；圖1 J）。利用飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠的獨(dú)立隊(duì)列，我們通過定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR；圖1 K）證實(shí)了Agxt1的抑制。

為了說明晚期NAFLD患者的甘氨酸生物合成基因是否同樣受到抑制，我們基于NASH患者肝臟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了meta分析。發(fā)現(xiàn)NASH患者的AGXT1以及AGXT2顯著下調(diào)，而催化甘氨酸降解為乙醛酸的D-氨基酸氧化酶（DAO）表達(dá)上調(diào)（β=0.216，P=0.0025；圖1L）。在來自肝移植供者（28例）的樣本中，我們發(fā)現(xiàn)AGXT1的表達(dá)與肝臟脂肪含量呈負(fù)相關(guān)（r=?0.196，P=0.0049；圖1M）。

圖1 NAFLD中甘氨酸生物合成受損。持續(xù)12周給C57BL / 6J小鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)食物（CD）或西方飲食（WD）：（A）血漿TC。（B）肝組織學(xué)。（C）TGs。（D）TC。（E）相對(duì)于CD的血漿氨基酸。（F）相對(duì)于甘油醛3-磷酸脫氫酶（Gapdh）的甘氨酸生物合成基因的肝臟表達(dá)。（G）細(xì)胞TGs。（H）200 mM PA或乙醇（EtOH）作用24h后HepG2細(xì)胞中AGXT1的表達(dá)。（I）肝形態(tài)學(xué)，H＆E和Sirius Red組織學(xué)。（J）通過CD或NASH飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟RNA測(cè)序顯著下調(diào)甘氨酸生物合成基因/途徑（藍(lán)色）。（K）飲食誘導(dǎo)NASH小鼠Agxt1相對(duì)GAPDH的表達(dá)。（L）通過對(duì)健康和NASH患者的肝臟數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析，甘氨酸代謝基因顯著下調(diào)（藍(lán)色）或上調(diào)（紅色）。（M）移植供者肝臟AGXT1表達(dá)與肝臟脂肪含量的Spearman相關(guān)分析（n=206）。

2 AGXT1缺失加劇飲食誘導(dǎo)的高脂血癥和NASH

為了研究AGXT1在HS中的潛在作用，我們首先使用小干擾RNA（siRNA）使HepG2細(xì)胞中的AGXT1沉默，從而增強(qiáng)了PA誘導(dǎo)的TG積累（圖2 A至C）。相反，AGXT1的過表達(dá)降低了細(xì)胞的TGs（圖2 D和E）。為了研究AGXT1在體內(nèi)丟失的影響，我們使用CRISPR-CAS9（圖2 F）建立了Agxt1^?/?小鼠。Western blot證實(shí)Agxt1^?/?小鼠的肝臟中沒有AGXT1（圖2 G），較低的甘氨酸/草酸血漿比例證實(shí)酶活性受損（圖2 H）。在標(biāo)準(zhǔn)飼料（CD）中，Agxt1^?/?小鼠的肝臟組織學(xué)與之前指出的Agxt1^+/+小鼠相似，我們還發(fā)現(xiàn)血漿肝酶和FAO、炎癥或纖維化基因的肝臟表達(dá)也是相似的。然而，在NASH飲食12周后，Agxt1^?/?小鼠的血漿TGs、TC、AST和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）升高（圖2 I至L）。肉眼可見Agxt1^?/?小鼠的腹膜腔較大，肝臟黃色增強(qiáng)（圖3 A）。盡管體重沒有顯著差異，但肝臟重量增加（圖3 B），并且與Agxt1^?/?小鼠的HS和纖維化增強(qiáng)有關(guān)（圖3 A，C和D）。H＆E和Sirius Red染色的組織學(xué)分析證實(shí)，Agxt1^?/?小鼠的NAFLD活性評(píng)分（NAS）和纖維化評(píng)分更高。

為了了解Agxt1^?/?小鼠中飲食加速誘發(fā)NASH的潛在機(jī)制，我們對(duì)Agxt1^+/+和Agxt1^?/?小鼠的肝臟進(jìn)行了測(cè)序，然后進(jìn)行了qPCR驗(yàn)證。通路分析顯示，Agxt1^?/?小鼠的能量代謝和FAO通路受到抑制，促炎通路上調(diào)（圖3G），調(diào)節(jié)過氧化物酶體和線粒體FAO的基因表達(dá)下調(diào)（圖3 H至J），而編碼促炎性信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子、纖維生成和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑的調(diào)節(jié)基因則被上調(diào)（圖3 H，K和L）。因此，肝特異性甘氨酸生物合成酶AGXT1在NAFLD中受到抑制，其缺乏會(huì)加速飲食引起的NASH。甘氨酸缺乏會(huì)加劇飲食引起的高脂血癥，高血糖癥和HS。

圖2 NASH飲食的Agxt1^?/?小鼠的血漿變化。用靶向AGXT1（siAGXT1）或非靶向siRNA對(duì)照（siCTL）的siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞：（A）相對(duì)于GAPDH的AGXT1 mRNA；（B）相對(duì)于GAPDH的AGXT1的Westernblot和定量密度測(cè)定；（C）細(xì)胞TGS。用帶有GFP標(biāo)簽的AGXT1質(zhì)?；騁FP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞：（D）AGXT1相對(duì)GAPDH的Western blot。（E）細(xì)胞TGS。（F）CRISPR-Cas9構(gòu)建Agxt1^?/?小鼠。（G）Western blot證實(shí)不存在AGXT1。（H）甘氨酸/草酸比值（n=8）、（I）TGS、（J）TC、（K）AST和（L）ALT（n=12）。

圖3 Agxt1^?/?加速小鼠飲食引起的NASH。（A）腹腔的總體外觀和肝臟組織學(xué)，（B）肝臟重量/體重比，（C）肝臟TG，（D）肝臟TC，（E） NAS，（F）纖維化評(píng)分。（G） Agxt1+/+和Agxt1?/?小鼠肝臟RNA測(cè)序后的通路分析。（H）NASH相關(guān)DEGs的熱圖。通過qPCR確認(rèn)（K）與炎癥相關(guān)和（L）與纖維化相關(guān)的DEGs。

3 DT-109：一種具有降糖降脂雙重性質(zhì)的甘氨酸三肽

考慮到上述發(fā)現(xiàn)，以及大量證據(jù)表明循環(huán)中較低的甘氨酸與血脂異常，以及糖尿病前期和T2D有關(guān)，我們推斷甘氨酸化合物可能通過降糖降脂雙重作用而具有治療潛力。因此，我們搜索了在結(jié)構(gòu)上與甘氨酸相似的化合物，并選擇了10個(gè)代表甘氨酸支架的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、靜電或等量構(gòu)型修飾的化合物，其中4種適合口服（半數(shù)致死劑量>1 mg/g）。長(zhǎng)期補(bǔ)充甘氨酸（1 mg/g/d）可降低Apoe^?/?小鼠的循環(huán)TGs，恢復(fù)糖耐量，加速肥胖C57BL/6小鼠的脂肪流失。在人類中，同時(shí)攝入甘氨酸和葡萄糖可使血糖升高的幅度降低50%以上。為了測(cè)試降糖效果，我們對(duì)給予甘氨酸或甘氨酸化合物（0.5 mg/g）的C57BL/6J小鼠進(jìn)行了口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTTS）。沒有一種被測(cè)試的化合物比甘氨酸更能有效地降低血糖的升高。另一種能降低小鼠血糖的氨基酸是亮氨酸。研究表明，甘氨酸和亮氨酸（Gly-Gly-L-Leu）結(jié)合的三肽DT-109具有顯著的降糖作用。我們對(duì)DT-109及其D-異構(gòu)體（Gly-Gly-D-Leu，DT-110）進(jìn)行了OGTT試驗(yàn)。結(jié)果表明DT-110的降糖作用與甘氨酸相似，而DT-109是唯一一種比甘氨酸更有效的降糖化合物。

4 DT-109改善身體成分，預(yù)防飲食引起的NASH

為了進(jìn)一步探索DT-109對(duì)NASH的治療潛力，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種實(shí)驗(yàn)方法來模擬晚期NAFLD（圖4 A）。與飼喂CD的小鼠相比，飼喂NASH飲食小鼠的循環(huán)葡萄糖、TC、AST和ALT升高。對(duì)部分小鼠進(jìn)行安樂死，證實(shí)NASH飲食喂養(yǎng)后肝臟重量增加。組織學(xué)分析顯示HS、肝細(xì)胞膨脹、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和早期纖維化。確認(rèn)NASH后，將其余小鼠隨機(jī)分為兩組，每天分別口服0.125 mg/g或0.50 mg/g的DT-109，或等量的亮氨酸、甘氨酸或水，以灌服CD+H2O的小鼠為對(duì)照（圖4 A）。

在第18周，OGTT和非空腹血糖測(cè)量證實(shí)了DT-109（0.5 mg/g/d）最有效的降糖作用。身體成分分析顯示，與CD組相比，NASH飲食中所有組的體重均增加（圖4 B）。與喂食NASH飲食和服用水的小鼠相比， DT-109（0.5 mg/g/d）治療的小鼠顯示出體內(nèi)脂肪減少，瘦肉得以保留（圖4 C和D），并且EAT和SAT脂肪細(xì)胞肥大減少，食物攝入無明顯差異。飲食引起的肥胖的代謝反應(yīng)涉及向脂肪和低碳水化合物利用的轉(zhuǎn)變，這反映了RER的降低。CLAMS分析顯示，所有接受NASH飲食的組中RER均降低，但在用DT-109（0.5 mg/g/d）治療的小鼠中，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。能量消耗或活動(dòng)沒有顯著差異。終點(diǎn)時(shí)，甘氨酸或DT-109抑制了喂食NASH的小鼠血漿AST、ALT和堿性磷酸酶（ALP）的增加（圖4E至G）。在用甘氨酸或DT-109處理的小鼠中血漿TGs降低（圖4 H），而通過DT-109（0.5 mg/g/d；圖4 I）的小鼠僅降低TC。因此，用甘氨酸或DT-109處理可顯著減輕NASH飲食誘導(dǎo)的嚴(yán)重肝腫大，而亮氨酸處理則不會(huì)（圖4 J和K），并且DT-109可顯著降低NAS（圖4 L）。

圖4 DT-109可以防止飲食引起的NASH。（A）以CD或NASH飲食喂養(yǎng)C57BL / 6J小鼠12周。確認(rèn)NASH后，小鼠隨機(jī)接受DT-109（0.125或0.5 mg/g/d）或等量的亮氨酸、甘氨酸（0.17，0.33 mg/g/d）或水，持續(xù)12周。（B）體重，（C）脂肪（％），（D）瘦體重（％）。終點(diǎn)血漿分析：（E）AST，（F）ALT，（G）ALP，（H）TG，（I）TC。（J）大體形態(tài)和H＆E組織學(xué)。（K）LW / BW比。（L）NAS。

5 DT-109對(duì)腸道菌群的影響

為了探索基于甘氨酸治療NASH的潛在機(jī)制，我們應(yīng)用了幾種方法，包括元基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)。為了研究以甘氨酸為基礎(chǔ)的NASH治療對(duì)腸道微生物群的反應(yīng)，我們利用16S核糖體DNA（rDNA）測(cè)序技術(shù)分析了治療前、治療2周和10周后的糞便微生物區(qū)系（圖4 A）。主成分分析（PCA）和操作分類單元（OTUs）的等級(jí)聚類顯示了NASH小鼠在治療前具有不同的微生物組成。線性判別分析（LDA）的效應(yīng)大?。↙EfSe）顯示，揭示了門水平的變化，包括NASH中Proteobacteria的增加，以及CD中Actinobacteria和Tenericutes的增加。在目水平上，Clostridiales在NASH中的數(shù)量顯著增加，而屬水平上，Clostridium sensu stricto的豐度增加了10倍。2周后，治療組之間出現(xiàn)微小差異。然而，10周后，喂食NASH并服用水或亮氨酸的小鼠的腸道微生物群與甘氨酸或DT-109小鼠的腸道微生物群顯著分離（圖5 A和B）。Clostridium sensu stricto在NASH中的比例仍然過高，但處理后的小鼠沒有這些差異，而Alistipes和Oscillibacter在CD中的表達(dá)過高（圖5 C）。為了確定與NASH嚴(yán)重程度相關(guān)的細(xì)菌，我們接下來評(píng)估了不同屬與NAFLD相關(guān)參數(shù)之間的相關(guān)性。

Oscillibacte、Alistipes和Pseudoflavonifractor與NAS、肝臟重量呈負(fù)相關(guān)，Clostridium sensu stricto與NAFLD相關(guān)參數(shù)均呈顯著正相關(guān)（P<0.01；圖5D）。在用DT-109治療或在用CD喂養(yǎng)的小鼠中，Clostridium sensu stricto的相對(duì)豐度降低了（圖5 E），而Alistipes的相對(duì)豐度卻提高了（圖5 F）。為了測(cè)試不同的微生物組成是否是由DT109處理直接造成的，我們接下來測(cè)試了DT-109對(duì)正常小鼠腸道微生物群的影響。給C57BL / 6J小鼠喂食相同的CD，并用DT-109或水處理10周。正如NASH飲食中發(fā)現(xiàn)的，DT-109顯著降低CD上的非空腹血糖，血漿TGs和TC（P <0.05；圖5 G至I），最終，DT-109處理的小鼠的腸道微生物群與水處理的小鼠分開聚類（圖5 J）。對(duì)OTUs和LEfSe的分析表明，DT-109處理的小鼠在門水平上Firmicutes減少，Bacteroidetes增加（圖5 K）。第8周DT-109組Clostridium sensu stricto的相對(duì)豐度降低，但對(duì)Alistipes、Pseudoflavonifractor和Oscillibacter沒有明顯影響（圖5 L和M）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在NASH飲食上觀察到的不同微生物組不太可能是DT-109的直接作用的結(jié)果，并導(dǎo)致我們進(jìn)一步探索了基于甘氨酸的療法預(yù)防NASH的機(jī)制。

圖5 DT-109對(duì)飼喂NASH小鼠或?qū)φ招∈竽c道微生物群的影響。（A）PCA，（B）各組中OTUs的等級(jí)聚類，（C）各組過表達(dá)菌群的LDA，（D）顯著差異的屬與NAFLD相關(guān)參數(shù)之間的相關(guān)性。（E） Clostridiumsensu stricto。（F）治療前（12周）、治療2周和10周后各組糞便樣本中的Alistipes。（G）終點(diǎn)非空腹血糖、（H）血漿甘油三酯和（I）總膽固醇。在開始和DT-109治療2、6、8和10周后采集糞便樣本：（J）終點(diǎn)PCA，（K）門水平比較，（L）Clostridium sensustricto，（M）整個(gè)研究過程中來自各組的糞便樣本的Alistipes。

6 DT-109逆轉(zhuǎn)了NASH飲食引起的轉(zhuǎn)錄組改變，F(xiàn)AO受損和肝脂毒性

為了進(jìn)一步探索潛在的機(jī)制，我們收集的肝臟進(jìn)行了RNA測(cè)序。PCA揭示，亮氨酸處理過的NASH飲食小鼠的基因表達(dá)譜與水相一致，而甘氨酸和DT-109（0.125 mg/g/d）飼喂處于基因表達(dá)譜的中間，DT-109 （0.5 mg/g/d）與CD飼喂更接近（圖6 A）?；鹕綀D顯示，相比于CD，灌胃水或亮氨酸的NASH飲食處理小鼠差異表達(dá)基因（DEGs）發(fā)生了重大變化，而甘氨酸或DT-109處理可顯著減少差異表達(dá)基因（圖6 B）。NASH飲食組的水對(duì)照組與DT-109組（0.5 mg/g/d）進(jìn)行比較，DT-109的通路分析模式與CD相似，表明DT-109逆轉(zhuǎn)了NASH飲食誘導(dǎo)的潛在通路的改變（圖6 C）。對(duì)與NASH發(fā)病的主要方面有關(guān)的基因的分析（圖6 D）顯示，調(diào)控FAO的關(guān)鍵基因在CD中過表達(dá)，而在灌胃水或亮氨酸的NASH小鼠中，這種作用受到抑制。qPCR分析證實(shí)，與 NASH飲食小鼠水對(duì)照組相比，灌胃甘氨酸或DT-109均顯著上調(diào)了Ppargc1a和Acot3/Acot4的表達(dá)，而Acsl1、Acaa2、Acadm/Acadl、Hadha、Eci1/Eci2和Acox1只被DT-109上調(diào)（0.5 mg/g/d；圖6E）。Western blot分析顯示，飼喂NASH的小鼠經(jīng)水或亮氨酸處理后，羥酰輔酶A脫氫酶α（HADHA）和乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2（ACAA2）的活性顯著降低，而甘氨酸或DT-109處理的小鼠則無明顯變化。與NASH小鼠水對(duì)照組相比，DT-109（0.5 mg/g/d）處理的小鼠ACAA2顯著增加（圖6F）。因此，用甘氨酸或DT-109處理降低了H2O或亮氨酸處理的NASH小鼠肝臟中標(biāo)記的HS（圖6，G至H）。尤其是已知能促進(jìn)NASH的二酰甘油（DAG）被DT-109顯著降低（0.5mg/g/d；P=0.0120；圖6I）。為了驗(yàn)證FAO相關(guān)基因的上調(diào)是否是由DT-109處理直接引起的，我們?cè)u(píng)估了DT-109處理10周的小鼠肝臟中的基因表達(dá)和脂質(zhì)譜。與NASH飲食的小鼠的研究結(jié)果相似，DT-109可以降低CD小鼠的肝臟TGs（圖6 J和K），并使調(diào)節(jié)FAO的基因上調(diào)（圖6 J和K）。海馬實(shí)驗(yàn)支持RNA測(cè)序、qPCR和Western印跡分析，顯示DT-109處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，耗氧率（OCR）增加，而用肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）抑制劑etomoxir阻斷FAO可減弱這一作用（圖6 L）。因此，以甘氨酸為基礎(chǔ)的治療誘導(dǎo)FAO，減少了NASH飲食誘導(dǎo)的HS和脂毒性。

圖6 以甘氨酸為基礎(chǔ)的治療糾正了由NASH飲食引起的FAO、HS和脂毒性受損。終點(diǎn)收集的肝臟RNA測(cè)序：（A）PCA，（B）火山圖：DEGs在NASH各組與CD組的差異（藍(lán)色，下調(diào)；紅色，上調(diào)），（C） NASH+H₂O與NASH+DT-109（0.5 mg/g/d）的通路分析。（D）與NASH相關(guān)的DEGs熱圖。（E）獨(dú)立樣本中FAO相關(guān)DEGs的qPCR驗(yàn)證；（F）Westernblot（n=4）。（G） ORO組織學(xué)。（H）肝TG，（I）DAG。C57BL/6J CD小鼠，給予DT-109（0.5 mg/g/d）治療10周。（J）與GAPDH相關(guān)的FAO相關(guān)基因的qPCR分析。（K）肝臟TG。（L）用或不用1 mM DT-109處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)，然后在不加或不加6m Metomoxir的情況下進(jìn)行海馬分析。

7 DT-109誘導(dǎo)肝臟谷胱甘肽從頭合成

通路分析表明，用DT-109（圖6 C）處理的小鼠肝臟谷胱甘肽代謝增加。RNA測(cè)序顯示，谷胱甘肽代謝調(diào)節(jié)基因和介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化保護(hù)的關(guān)鍵基因在是水或亮氨酸處理的NASH小鼠中表達(dá)下調(diào)，而經(jīng)甘氨酸或DT-109處理則減弱（圖7 A）。qPCR分析證實(shí)，甘氨酸或DT-109處理可上調(diào)Gstt2，Gstt3，Gsta3和Nat8，而Prdx4，Sod2和Txn2僅在DT-109處理中上調(diào)（圖7 B）。使用硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)對(duì)脂質(zhì)過氧化的評(píng)估表明，經(jīng)水或亮氨酸處理的NASH小鼠肝臟中丙二醛（MDA）濃度增加，而甘氨酸或DT-109處理減弱了丙二醛濃度增加（圖7 C）。為了探索基于甘氨酸的治療對(duì)從頭合成GSH的貢獻(xiàn)，我們使用¹³C₅標(biāo)記的谷氨酰胺在甘氨酸和DT109存在或不存在的情況下對(duì)AML-12肝細(xì)胞進(jìn)行代謝通量分析（圖7 D）。液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）證實(shí)細(xì)胞攝取甘氨酸和DT-109（圖7 E和F）。在從頭合成的GSH中，摻入¹³C₅谷氨酰胺會(huì)產(chǎn)生+5質(zhì)量（M+5）位移，LC-MS可以檢測(cè)到該位移。在沒有甘氨酸或DT-109時(shí)，谷胱甘肽前體谷氨酸和g-谷氨酰半胱氨酸積累（圖7 G和H），表明添加甘氨酸或DT-109后釋放了阻滯劑。甘氨酸或DT-109處理的細(xì)胞GSH顯著增加（P < 0.01）（圖7 I），特別是M + 5 GSH（圖7 J），這表明GSH是重新合成的。為了測(cè)試DT-109是否在體內(nèi)促進(jìn)肝臟谷胱甘肽的形成，我們?cè)诳诜﨑T-109之前和之后收集小鼠的肝臟，肝臟GSH在60和120 min后顯著升高（P < 0.05;圖7 k）。最后，與NASH飲食小鼠相似，DT-109處理的CD小鼠肝臟中調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝的基因上調(diào)（圖7 L）。因此，基于甘氨酸的處理通過從頭合成谷胱甘肽誘導(dǎo)抗氧化防御。

圖7 基于甘氨酸的處理的通過從頭合成GSH的抗氧化作用。（A）所有實(shí)驗(yàn)組中與氧化還原相關(guān)的DEGs的熱圖。（B）獨(dú)立樣本中相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證。（C）肝MDA。（D）¹³C₅標(biāo)記的谷氨酰胺，半胱氨酸和甘氨酸從頭合成GSH的示意圖。通過LC-MS確定細(xì)胞代謝物的同位素譜分布：（E）甘氨酸，（F）DT-109，（G）谷氨酸，（H）γ-谷氨酰半胱氨酸，（ I）GSH，（J）GSH的M + 5同位素。（K）對(duì)C57BL /6J小鼠口服DT-109（0.5 mg / g）30、60和120分鐘的肝臟GSH的LC-MS分析。（L）CD小鼠使用DT-109（0.5mg /g）處理10周。定量PCR檢測(cè)與GAPDH相關(guān)的調(diào)節(jié)GSH代謝的基因在肝臟中的表達(dá)。

8 DT-109降低NASH飲食誘導(dǎo)的肝炎癥和纖維化

RNA測(cè)序分析顯示，基于甘氨酸的治療抑制了關(guān)鍵的炎癥通路/基因，提示抗炎作用。F4/80（一種公認(rèn)的肝巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）的免疫染色在水或亮氨酸處理的NASH小鼠肝臟中顯著增加，但在甘氨酸或DT-109處理小鼠中減弱（圖8 A和B）。在血漿中，水或亮氨酸治療的NASH小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1/CCL2）和抵抗素（NASH患者已知的炎癥標(biāo)記物）增加，但甘氨酸或DT-109處理的小鼠中沒有這種現(xiàn)象（圖8 C和D）。與水處理NASH小鼠相比，用DT-109（0.5 mg/g/d）治療的小鼠血漿MCP-1濃度顯著降低（圖8 C）。RNA測(cè)序揭示了編碼促炎信號(hào)調(diào)節(jié)因子（Nfkb1、Nfkb2、Relb、Ccr1、Ccr2、Ccr5、Tlr1、Tlr2、Tlr4、Tnfrsf1a、Tnfrsf9和Tnfrsf12）和細(xì)胞因子（Tnf、Ccl2和Ccl5）基因表達(dá)在水或亮氨酸處理的NASH小鼠中上調(diào)，但在甘氨酸或DT-109處理小鼠中減弱（圖6 D）。qPCR分析證實(shí)，甘氨酸或DT-109顯著下調(diào)了Nfkb2、Relb和Tnf（P <0.05），而被認(rèn)為是NASH治療靶點(diǎn)的Ccl2和Ccr5僅被DT-109下調(diào)（0.5mg/g/d；圖8E）。因此，基于甘氨酸的治療減少了NASH飲食引起的全身和小葉炎癥，并抑制了NF-kB靶基因。

RNA測(cè)序還表明，與TGFb信號(hào)和和ECM重塑相關(guān)的通路/基因在NASH飲食中上調(diào)，而在甘氨酸或DT-109處理下減弱（圖6 C和D）?；赟irius Red的組織學(xué)分析顯示，甘氨酸或DT-109（而非亮氨酸）對(duì)NASH飲食引起的肝纖維化具有保護(hù)作用（圖8 A，F(xiàn)和G）。這些結(jié)果以及血漿AST，ALT或ALP與個(gè)體纖維化評(píng)分之間呈顯著正相關(guān)（P <0.0001），表明甘氨酸或DT-109減輕了NASH飲食引起的肝損害。為了測(cè)試基于甘氨酸的治療是否能減輕TGFβ介導(dǎo)的肝纖維化，我們分析了SMAD信號(hào)，發(fā)現(xiàn)DT-109可以降低SMAD2Ser^{465 / 467}磷酸化（圖8 H）。qPCR分析證實(shí)，在水或亮氨酸處理的NASH小鼠肝臟中TGFβ相關(guān)基因顯著上調(diào)，而DT-109可以減弱這一現(xiàn)象（圖8 I）。因此，基于甘氨酸的治療可以降低NASH飲食引起的脂肪性肝炎和纖維化。

圖8 以甘氨酸為基礎(chǔ)的治療減少了NASH飲食引起的肝臟炎癥和纖維化。（A）F4/80免疫組織化學(xué)和SiriusRed組織學(xué)檢查。（B）F4/80陽性區(qū)域。（C） Plasma MCP-1。（D）抵抗素。（E）獨(dú)立樣本中炎癥相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證。（F） Sirius Red陽性區(qū)域。（G）纖維化評(píng)分。（H）磷酸化Smad2（Ser465/467）和總SMAD2的Western blot。（I）纖維化相關(guān)DEGs的qPCR驗(yàn)證。

討論

我們的發(fā)現(xiàn)表明，NAFLD中發(fā)現(xiàn)的較低的甘氨酸與抑制肝甘氨酸生物合成基因有關(guān)。特別是在鼠類和人類NASH中，我們發(fā)現(xiàn)了AGXT1被顯著抑制，阻止了乙醛酸酯向甘氨酸的轉(zhuǎn)化。Agxt1^-/-小鼠肝臟的蛋白質(zhì)組學(xué)表明葡萄糖和脂質(zhì)代謝途徑發(fā)生了改變，但以前尚未評(píng)估AGXT1在NASH中的作用。Agxt1^-/-小鼠在接受NASH飲食12周后 NASH加劇。本文確定了抑制FAO途徑的方法，該方法進(jìn)而促進(jìn)了Agxt1^-/-小鼠的脂肪性肝炎和纖維化，支持了甘氨酸代謝受損在NASH中起病因作用的前提。

進(jìn)一步應(yīng)用飲食方法限制了甘氨酸的利用率，并通過給Apoe^-/-小鼠飼喂含或不含甘氨酸的WD，從而同時(shí)研究血脂異常，糖耐量降低和HS。這些發(fā)現(xiàn)表明甘氨酸缺乏癥在NAFLD中起致病作用。在一項(xiàng)以脂肪性肝炎和纖維化并存為特征的晚期NAFLD的長(zhǎng)期飲食模型的全面調(diào)查中，記錄了甘氨酸的保護(hù)作用。

為了尋找比甘氨酸更有效的雙重降糖/降脂甘氨酸化合物，本文測(cè)試了甘氨酸和亮氨酸的組合，亮氨酸是另一種先前報(bào)道可以改善小鼠葡萄糖耐量和降低HS的氨基酸。通過應(yīng)用不同的T2D模型，發(fā)現(xiàn)DT-109三肽的降糖效果超過游離甘氨酸、亮氨酸或它們的二肽組合。高脂血癥和NAFLD小鼠模型顯示DT-109還可以改善血脂、HS和NASH。與之前報(bào)道不同，我們沒有觀察到用亮氨酸治療的小鼠的實(shí)質(zhì)性影響。然而，甘氨酸治療后的代謝益處是明顯的。此外，較低劑量的DT-109（0.125 mg/g/d）也有明顯的益處。每天0.5 mg/g的DT-109治療可防止NASH飲食誘導(dǎo)的身體成分改變，并降低肝臟DAG和NAS，表明DT-109在預(yù)防飲食誘導(dǎo)的NASH方面比同等劑量的甘氨酸更有效。

本文研究有一些局限性，反過來也可能成為未來研究的方向。人體研究?jī)H限于轉(zhuǎn)錄學(xué)，重點(diǎn)是與非酒精性脂肪肝相關(guān)的調(diào)節(jié)甘氨酸代謝的基因表達(dá)的改變，未來的臨床研究有必要評(píng)估基于甘氨酸的治療非酒精性脂肪肝（NAFLD）的可能性。雖然我們使用了一種長(zhǎng)期的高脂肪、膽固醇和果糖飲食模型，在該模型中，小鼠表現(xiàn)出人類NASH的組織學(xué)和代謝特征，但其他模型也可以用于研究DT-109的作用。通過研究DT-109在NASH小鼠和健康小鼠中的作用，我們發(fā)現(xiàn)了相似的生理結(jié)果，包括降低循環(huán)中的血糖、血脂和肝臟脂肪，同時(shí)誘導(dǎo)肝臟中FAO和GSH的合成。因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)患有NASH的小鼠和健康小鼠灌胃DT-109腸道微生物群的變化不同，因此與腸道微生物群相關(guān)的一些方面值得進(jìn)一步研究。關(guān)于DT-109是否可以直接和不同地影響微生物菌群與宿主生理的關(guān)系，可以在未來的研究中進(jìn)行評(píng)估，尤其是DT-109對(duì)腸道微生物群及其代謝組的影響，提高人們對(duì)微生物群對(duì)NAFLD貢獻(xiàn)的理解，發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療方法。

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