脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）是人體腸道微生物組的重要成員，具有改善臨床前動(dòng)物模型中炎癥和行為癥狀的有益特性。該共生物表現(xiàn)出顯著的單一菌株穩(wěn)定性并在腸粘膜表面的富集定植。為了探索脆弱擬桿菌與宿主上皮的相互作用的物理特征，研究人員使用透射電子顯微鏡（TEM）來觀察單克隆小鼠的結(jié)腸組織。脆弱擬桿菌通常在頂端上皮表面上形成緊密包裹細(xì)胞的離散聚集體（圖1A）并穿透跨膜粘蛋白的糖萼層，幾乎接觸微絨毛（圖1B和圖S1A、S1B）。還發(fā)現(xiàn)了完整的脆弱擬桿菌細(xì)胞，其位于Lieberkühn隱窩的管道中（圖1C和圖S1C）。

研究人員之前在脆弱擬桿菌中發(fā)現(xiàn)了遺傳基因座，命名為共生定植因子（ccfABCDE），這是在結(jié)腸隱窩定植所必需的。為了評(píng)估這些基因如何影響細(xì)菌定位到粘膜表面，研究人員用ccfCDE（Δccf）突變體使小鼠腸道菌群?jiǎn)我欢ㄖ?，然后通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)，脆弱擬桿菌Δccf在上皮粘膜內(nèi)僅為稀疏的單個(gè)細(xì)胞，不與糖萼的接觸（圖1D和1E），并且從未在聚集體中觀察到野生型細(xì)菌（圖1F）。

結(jié)腸腔內(nèi)的脆弱擬桿菌負(fù)荷在菌株之間是相同的（圖S2A），表明粘液內(nèi)的細(xì)菌聚集需要CCF系統(tǒng)。體內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞的高分辨率X線斷層圖顯示存在覆蓋野生型脆弱擬桿菌的厚的模糊被膜層（圖1G），其在脆弱擬桿菌Δccf中顯著降低（圖1H和1I）。研究人員試圖研究這種超微結(jié)構(gòu)變化背后的細(xì)菌生理學(xué)，以及其對(duì)定植的潛在影響。在腸道定植和粘蛋白O-聚糖中的細(xì)菌生長(zhǎng)期間ccf基因座被高度誘導(dǎo)，表明CCF系統(tǒng)可以感知特定宿主衍生的聚糖。

圖1

圖S1

ccf基因與多糖利用系統(tǒng)同源，其中σ因子（ccfA）被細(xì)胞外聚糖感知激活，因此研究人員假設(shè)ccfA可激活參與粘膜定植的基因。研究人員在脆弱擬桿菌中過表達(dá)ccfA，并在體外生長(zhǎng)期間通過RNAseq評(píng)估全基因表達(dá)（沒有過表達(dá)的ccf在培養(yǎng)物中表達(dá)很差）。在由ccfA調(diào)節(jié)的非ccf基因中，25個(gè)基因中的24個(gè)映射到莢膜多糖A和莢膜多糖C（PSA和PSC）的生物合成基因座（圖2A和2B，以及表S1）。相應(yīng)地，ccf突變降低了PSC的表達(dá)并增加了體內(nèi)PSA的表達(dá)（圖2C）。雖然已知莢膜多糖的相變會(huì)影響脆弱擬桿菌的一般體內(nèi)適應(yīng)性，但這些研究在粘膜定植的背景下鑒定了特定多糖的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑。

研究人員使用水平透射測(cè)定法模擬單菌株穩(wěn)定性，其中分別攜帶野生型脆弱擬桿菌的同基因菌株的共同飼養(yǎng)動(dòng)物導(dǎo)致從一只動(dòng)物到另一只動(dòng)物的最小菌株傳遞（圖2D和圖S2A）。通過細(xì)菌占據(jù)物種特異性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或空間生態(tài)位來提供這種種內(nèi)定殖抗性。然而，如先前報(bào)道的那樣，如果小鼠最初被脆弱擬桿菌Δccf定植，在共同飼養(yǎng)后，動(dòng)物將允許野生型脆弱擬桿菌共同定植（圖2E和圖S2B），表明生態(tài)位飽和度中依賴CCF的缺陷。在PSC的生物合成基因（ΔPSC）中攜帶突變體的小鼠顯示出野生型細(xì)菌的高度可變的共定植（圖2F和圖S2C）。有趣的是，研究人員觀察到該突變體中PSB生物合成基因表達(dá)的意外增加（圖2H），這可以補(bǔ)償PSC的損失。研究人員在合成PSB和PSC（ΔPSB/ C）時(shí)生成了缺陷菌株，雖然菌株保留了ccf表達(dá)（圖S2G），但與雙突變體單相關(guān)的小鼠始終不能維持定植抗性（圖2G和圖S2D到S2F）。

盡管在單一定植環(huán)境中缺乏競(jìng)爭(zhēng)，并且結(jié)腸腔中存在均等的定植水平（圖S2H），但脆弱擬桿菌Δccf和ΔPSB/ C菌株在升結(jié)腸粘液的定植方面存在缺陷（圖2I），反映粘膜生態(tài)位飽和度受損。因此，當(dāng)研究人員使用TEM對(duì)體內(nèi)ΔPSB/ C株進(jìn)行成像時(shí)，盡管被膜不像脆弱擬桿菌Δccf那么?。▓DS2I和S2J），但與野生型細(xì)菌相比，消除了標(biāo)志性上皮聚集表型（圖S2K和S2L）。因此，研究人員得出結(jié)論，CCF系統(tǒng)調(diào)節(jié)被膜表達(dá)以介導(dǎo)脆弱擬桿菌粘膜定植和單一菌株穩(wěn)定性。

圖2

圖S2

表S1

為了研究有助于粘膜定植的宿主反應(yīng)，研究人員在野生型脆弱擬桿菌或脆弱擬桿菌Δccf定植期間分析了升結(jié)腸的轉(zhuǎn)錄組。值得注意的是，14種差異表達(dá)基因中的7種編碼免疫球蛋白可變鏈（圖3A和表S2）。研究人員沒有觀察到Δccf定植的小鼠中任何免疫應(yīng)答的升高（圖S3A），表明粘膜結(jié)合的變化不是由炎癥引起的。因此，研究人員測(cè)試了ccf對(duì)莢膜多糖的調(diào)節(jié)是否影響細(xì)菌對(duì)IgA的識(shí)別。

在來自單一定植動(dòng)物的糞便樣品中，野生型脆弱擬桿菌被IgA高度包被，其在Δccf和ΔPSB/ C菌株中顯著減少（圖3B和3C，以及圖S4A）。研究人員觀察到這些菌株在誘導(dǎo)總糞便IgA方面沒有差異（圖3D），反映了非特異性IgA產(chǎn)生的等效刺激。

為了測(cè)試細(xì)菌特異性反應(yīng)，評(píng)估用從脆弱擬桿菌單定植化的小鼠的糞便中提取的IgA與從單結(jié)構(gòu)化Rag1^-/-小鼠（體內(nèi)適應(yīng)但不含IgA的細(xì)菌）中回收的細(xì)菌的結(jié)合。細(xì)菌裂解物的蛋白質(zhì)免疫印跡顯示在Δccf和ΔPSB/ C菌株中消除了對(duì)莢膜多糖的強(qiáng)IgA反應(yīng)性（圖3E和3F）。盡管IgA可以是多反應(yīng)的，但與擬桿菌的裂解物的結(jié)合是物種特異性的（圖S4B），并且需要在細(xì)菌定植后誘導(dǎo)IgA（圖S4C和S4D）。

因此，在整個(gè)細(xì)菌結(jié)合測(cè)定中，與Δccf和ΔPSB/ C菌株相比，野生型細(xì)菌誘導(dǎo)的IgA最大程度地包被野生型脆弱擬桿菌（圖3G）。由脆弱擬桿菌Δccf誘導(dǎo)的IgA表現(xiàn)出與野生型細(xì)菌的結(jié)合降低（圖3G）。向體內(nèi)適應(yīng)的無(wú)IgA細(xì)菌中添加IgA增加了脆弱擬桿菌在組織培養(yǎng)中對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附（圖3H），但對(duì)細(xì)菌活力沒有影響（圖S4E）。產(chǎn)生更多粘液的細(xì)胞系表現(xiàn)出更大的IgA增強(qiáng)的脆弱擬桿菌粘附能力（圖S4F），與先前表明IgA結(jié)合粘液的工作一致。

重要的是，如果靶細(xì)菌缺乏ccf或PSB / C，或者如果測(cè)試的IgA是由ccf突變體或擬桿菌擬桿菌誘導(dǎo)的，則IgA增強(qiáng)的依從性降低（圖3H和圖S4G）。雖然致病細(xì)菌精細(xì)化莢膜多糖用于免疫逃避，但這些結(jié)果表明脆弱擬桿菌展開特異性被膜用于免疫吸引，可能形成穩(wěn)定的粘膜定植。

圖3

圖S3-S4

表S2

隨后，研究人員確定了IgA包被是否促進(jìn)小鼠中的脆弱擬桿菌定植。使用水平傳播范例，用野生型脆弱擬桿菌定殖的Rag1^-/-小鼠很容易被來自攜帶動(dòng)物的同基因菌共同定殖（圖S5A和S5B），顯示在適應(yīng)性免疫缺陷時(shí)缺乏定植抗性。接下來，研究人員用抗CD20抗體（圖S5C）處理野生型小鼠以消耗B細(xì)胞（圖S5D至S5F），從而減少總糞便IgA水平（圖S5G）并在單結(jié)構(gòu)化過程中消除野生型脆弱擬桿菌的IgA涂層（圖4A）。從同種型對(duì)照處理的小鼠中回收IgA，也用脆弱擬桿菌單克隆化，在體外促進(jìn)野生型細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的粘附，而抗CD20處理的小鼠的IgA盡管暴露于脆弱擬桿菌抗原但沒有作用（圖4B）。

在水平透射測(cè)定中，用脆弱擬桿菌單克隆化的B細(xì)胞耗盡的小鼠容易被野生型細(xì)菌侵入，而同種型對(duì)照注射的動(dòng)物保留了定殖抗性（圖4C和圖S5H）。因此，活性B細(xì)胞對(duì)脆弱擬桿菌定植的反應(yīng)增強(qiáng)了單菌株穩(wěn)定性。

由于B細(xì)胞耗竭消除了所有抗體同種型，因此產(chǎn)生了無(wú)菌IgA^-/-小鼠并用脆弱擬桿菌單克隆化。研究人員沒有觀察到IgM的補(bǔ)償性涂層（圖S6A）。在野生型（BALB / c）和IgA^-/-小鼠的水平傳播試驗(yàn)中，缺乏IgA會(huì)允許攻擊菌株共定殖（圖4D和圖S6，B至D），表明IgA對(duì)單一穩(wěn)定性的特異性貢獻(xiàn)。該特征在具有完整微生物群落的小鼠中被復(fù)制，所述微生物群落“摻入”具有遺傳標(biāo)記的脆弱擬桿菌菌株（圖S6E和S6F），揭示了單個(gè)細(xì)菌物種的單一應(yīng)變穩(wěn)定性發(fā)生在復(fù)雜群落的背景中。與野生型小鼠相比，單克隆化的IgA^-/-小鼠在結(jié)腸粘液中具有降低的活細(xì)菌水平（圖4E），盡管它們?cè)诮Y(jié)腸腔中具有更多的細(xì)菌（圖S6G）。

升結(jié)腸組織的TEM圖像顯示，在IgA^-/-動(dòng)物中，野生型脆弱擬桿菌不能在上皮表面聚集（圖4F和4G），類似于野生型中的ccf和PSB / C突變體。脆弱芽孢桿菌細(xì)胞在IgA存在下也在糞便中形成聚集體（圖S7），表明增強(qiáng)的粘膜定植可能是由于粘液內(nèi)聚集或生長(zhǎng)增加。這些發(fā)現(xiàn)支持一種模型，其中ccf調(diào)節(jié)特定莢膜多糖的表達(dá)以吸引IgA結(jié)合，從而允許強(qiáng)大的粘膜定植和單菌株穩(wěn)定性。

除了脆弱擬桿菌之外，研究人員測(cè)試了在將小鼠微生物群控制引入無(wú)菌BALB / c或IgA^-/-小鼠后，IgA是否形成復(fù)雜的微生物組。在定植后一個(gè)月，盡管兩種小鼠基因型的糞便中具有相似的微生物組譜（圖S8A），研究人員觀察到特定分類群的差異（表S3）。研究人員還發(fā)現(xiàn)IgA^-/-小鼠結(jié)腸粘液和結(jié)腸腔之間的社區(qū)分層缺陷（圖4H和圖S8B），揭示了這兩個(gè)解剖位置之間的微生物組譜需要IgA來個(gè)體化。值得注意的是，與BALB / c小鼠（圖4I和圖S9A）相比，IgA^-/-小鼠粘液中獨(dú)特地映射到脆弱擬桿菌的高度粘液富集的精確序列變體（ESV）顯著減少，此現(xiàn)象可支持研究人員從觀察單一定植小鼠中獲得的結(jié)果。

為了將這種分析擴(kuò)展到其他微生物物種，研究人員將理研菌科（Rikanellaceae）、Blautia sp.和分段絲狀細(xì)菌（SFB）鑒定為高度IgA包被（圖S9B），并評(píng)估結(jié)腸或回腸粘液中這些分類群的豐度。在沒有IgA的情況下，Blautia sp.和分段的絲狀細(xì)菌（SFB）顯示出與粘膜的聯(lián)系增加（圖4I），證明IgA可以保護(hù)腸屏障。然而，類似于脆弱擬桿菌，Rikanellaceae在結(jié)腸粘液中高度豐富并且在IgA^-/-小鼠中顯著耗盡（圖4I）。研究人員得出結(jié)論，IgA增強(qiáng)的粘膜定植發(fā)生在多個(gè)脆弱擬桿菌菌株和腸道微生物組的其他物種的復(fù)雜群落中。

圖4

圖S5-S9