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大家分享的一個問題是：純化所得組分中沒有收集到重組的His標(biāo)簽蛋白。該問題主要可以分為以下兩個方面： 1 His標(biāo)簽蛋白沒有結(jié)合到 填料上就流穿了 超聲的功率不對。超聲功率過高，容易導(dǎo)致蛋白炭化；功率過低，蛋白釋放不出來。 建議 改變超聲功率，同時可以在超聲前加入溶菌酶。 原因二 結(jié)合緩沖液條件不合適。 建議 檢查結(jié)合緩沖液中是否有影響結(jié)合的因素，如：金屬離子螯合劑、強還原劑、過高的咪唑濃度。同時，優(yōu)化緩沖液的pH、鹽離子濃度、添加劑（如5%甘油、1mM DTT）等。 原因三 His標(biāo)簽沒有表達(dá)或丟失或暴露不充分。 建議1 用anti-His的抗體進(jìn)行WB，檢測His標(biāo)簽是否存在。 建議2 將蛋白用4-6M鹽酸胍或4-8M尿素變性后，讓His標(biāo)簽充分暴露出來，看是否能與填料結(jié)合。 建議3 改變His標(biāo)簽的位置或者增加其數(shù)目（常用6-12個His），增加暴露和結(jié)合機會。 建議4 改變金屬結(jié)合離子，除了Ni2+，Cu2+、Zn2+、Co2+也可以用來進(jìn)行His標(biāo)簽的捕獲。 2 His標(biāo)簽蛋白結(jié)合了，但是洗脫不充分 原因一 洗脫條件太溫和。 建議 增加咪唑的濃度或選擇咪唑線性梯度洗脫，或者通過降低pH尋找最佳洗脫條件。需要注意的是，pH低于3.5容易導(dǎo)致鎳離子脫落。 原因二 蛋白柱上沉淀。 建議1 降低蛋白濃度?？梢詼p少上樣量，或者采用咪唑線性而非步級梯度洗脫，增加蛋白稀釋度。 建議2 試用去污劑或者改變NaCl的濃度，或者使用變性劑（4-6M鹽酸胍或4-8M尿素）在變性條件下洗脫。 原因三 非特異性的疏水或者其他相互作用。 建議 加非離子型去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度洗脫。 |
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