本文為GE公司His融合蛋白純化中常見問題解答集錦，對鎳柱純化摸索條件階段幫助很大，貼出來供廣大生命科學(xué)同行者參考，如有侵權(quán)請聯(lián)系刪除。

摘要： His-tag是專門設(shè)計用于重組蛋白質(zhì)的純化，與其他標(biāo)簽相比有很多明顯優(yōu)勢，是目前用于純化的融合標(biāo)簽中使用最為廣泛的一種。Tag雖然簡單，但是做過的人都知道，融合蛋白的純化并非簡單。純化介質(zhì)有10多種，應(yīng)該如何選擇？洗脫的標(biāo)簽蛋白雜帶較多是什么原因？如何優(yōu)化？甚至洗脫產(chǎn)物中沒有目標(biāo)蛋白原因為何？策略如何？GE蛋白質(zhì)純化專家就His-Tag融合蛋白在純化過程中常常遇到的問題進(jìn)行解答，不容錯過！

純化的組分中沒有His標(biāo)簽的蛋白?

經(jīng)常我們的客戶反饋沒有純化到His標(biāo)簽蛋白,不要著急，我們——來排除可能的原因，首先確定是蛋白沒有掛上柱子都流穿了，還是蛋白沒有被洗脫下來,然后——檢查原因：若His標(biāo)簽蛋白沒有結(jié)合上去都流穿了，請依次檢查：

·可能原因：超聲的功率不對(太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放)
策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶
 

·可能原因：樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確：
策略：檢測pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液 中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。
 

·可能原因：組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露
策略：在變性條件下(用4－8 M 脲，或4－6 M鹽酸胍)進(jìn)行純化。
 

·可能原因：HIS標(biāo)簽丟失,
策略1：WB或者anti-his的抗體檢查His是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變his-tag的位置(C-terminal or N-terminal)，必要時增加his個數(shù)(常用6-10個)。
策略2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。
策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。

Ni2+通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)(組氨酸)6 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的首選金屬離子，也是一般最常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用Ni2+?？梢岳?/span>Hitrap IMACHP來篩選不同的金屬離子，具體應(yīng)用實例請參考《Recombinant Protein Purification Handbook》。

若沒有洗脫下來，請依次檢查：

·可能原因：洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）
策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。
 

·可能原因：降低PH的方法洗脫的,因為若pH低于3.5,會導(dǎo)致鎳離子脫落
策略：改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫
 

·可能原因：蛋白已沉淀在柱上
策略：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度，或在變性條件(去折疊)下洗脫(用4－8 M脲，或4－6 M 鹽酸胍)。
 

·可能原因：非特異性疏水或其他相互反應(yīng)
策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的濃度。
 

HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多,什么原因? 如何優(yōu)化?

高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也會帶有HIS，所以經(jīng)常會出現(xiàn)HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優(yōu)化的方法如下：

·可能原因：蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白,
策略：請?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?/span>(慎用EDTA)。
 

·可能原因：雜質(zhì)對鎳離子有更高的親和性
策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合)和高產(chǎn)率(組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合)之間的最佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優(yōu)的咪唑結(jié)合和清洗濃度；在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大(20 個或更多的柱床體積)，可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白。

策略2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCl濃度，pH的范圍都需要進(jìn)行篩選以下是(His)6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF96孔板上進(jìn)行緩沖液條件的篩選以便決定最適的結(jié)合和洗脫條件。對于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時，將緩沖液、鹽、甘油和還原劑設(shè)計成96個不同的混合配方。實驗結(jié)果顯示對于該目標(biāo)蛋白25mMTris，10mMNaCl，10％甘油，pH8.5的緩沖液適最佳的結(jié)合條件。

策略3：若以上優(yōu)化的條件都不能去除雜質(zhì)蛋白，需要考慮多步純化的思路，離子交換(HiTrap Q HP or HiTrap SPHP) 和凝膠過濾(Superdex?Peptide，Superdex 75 or Superdex200) 是必須的.以下是用?KTAxpress儀器進(jìn)行四步純化的實例。AC(親和)，DS(脫鹽)，IEX(離子交換)，GF(凝膠過濾)所有的步驟都在?KTAxpress上自動執(zhí)行,包括柱上的標(biāo)簽酶切。文章出處《Recombinant Protein Purification Handbook》
 

·可能原因：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起
策略：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，( 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20)；或者在wash buffer中增加甘油的濃度(50%)減少非特異性的相互反應(yīng)；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。
 

·可能原因：洗滌不充分
策略：增加洗滌的次數(shù),使洗滌充分。