人類基因組究竟有多少基因兼談Salzberg最新bioRxiv研究

“人，宇宙之精靈，萬(wàn)物之靈長(zhǎng)”?？茖W(xué)家，這一人類中的所謂精英群體自然擔(dān)負(fù)起了為人類的自負(fù)找尋基因證據(jù)的重任。早在上世紀(jì)六十年代，生物學(xué)家就開始了對(duì)人到底有多少基因的探索的坎坷之旅。

1964年，來(lái)自德國(guó)海德堡大學(xué)的Friedrich Vogel獨(dú)闖龍?zhí)叮律硪蝗诉M(jìn)行了歷史上對(duì)于人類基因組數(shù)目的第一次計(jì)算。為何是1964年？又到底需要多少基因才能創(chuàng)造位居萬(wàn)物靈長(zhǎng)的人類？

Vogel計(jì)算的第一個(gè)基石源于此前對(duì)于人類染色體重量的測(cè)量。Mirsky and Ris (1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出人類單倍體的染色體大小為2.72 × 10^?12 g。綜合其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為簡(jiǎn)明，Vogel選擇了3 x 10^-12g作為人類單倍體基因組的重量。已知一對(duì)核苷酸的質(zhì)量為1.026 x 10^-21g（GC對(duì)和AT對(duì)相差甚微），據(jù)此Vogel估算人類基因組的大小為30億個(gè)堿基對(duì)——這一估算與今天的測(cè)序結(jié)果驚人接近。

Vogel的第二個(gè)基礎(chǔ)來(lái)自上世紀(jì)60年代初對(duì)血紅蛋白（hemoglobin）的alpha和beta亞基的氨基酸序列的破解，結(jié)果表明它們分別有141和146個(gè)氨基酸。Vogel認(rèn)為，根據(jù)斯韋德貝里法則（Svedberg's law），許多蛋白是多亞基（multi-subunit）結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基的分子量大約是17500KDa。而如果20種氨基酸的平均分子量為128KDa，則可以計(jì)算出每個(gè)蛋白的長(zhǎng)度大約為150個(gè)氨基酸——這也是Vogel計(jì)算的第一個(gè)基本假設(shè)。當(dāng)時(shí)，克里克等人剛剛提出了密碼子（codon）的規(guī)則(2)，人們知道一個(gè)氨基酸由DNA上的三個(gè)堿基編碼。綜上，Vogel計(jì)算出編碼一個(gè)人的蛋白大致需要450堿基。這一數(shù)目在今天看來(lái)，盡管是低估了，但也過(guò)得去。Vogel引用的斯韋德貝里法則的冠名者斯韋德貝里，是大名鼎鼎的膠體理論學(xué)家、1926年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主，大概該結(jié)果也代表了當(dāng)時(shí)人類的最高認(rèn)知水平吧。

如果到此為止，Vogel的這篇文章可以說(shuō)是沒(méi)有什么破綻的，但大概也不會(huì)入Nature挑剔的編輯和審稿人的法眼。為計(jì)算人類基因的總數(shù)，Vogel進(jìn)一步作了下面兩假設(shè)：一是編碼每個(gè)基因的序列都是連續(xù)的，二是人類基因組從頭至尾全都是編碼蛋白的序列（也就是不存在所謂的非編碼區(qū)）。于是，Vogel得出了人類基因組含有6.7x10⁶個(gè)基因的結(jié)論。

這一在今天看起來(lái)有些滑稽的結(jié)果在當(dāng)年確是合理且引人入勝的。要知道，Vogel做出得一結(jié)果的時(shí)候距離Sharp和Roberts發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子尚有13年之久，且人類對(duì)于基因組中非編碼區(qū)更是一無(wú)所知。總之，這些因素，都嚴(yán)重影響了Vogel的計(jì)算，導(dǎo)致其極其嚴(yán)重高地估了基因數(shù)目。

人類基因組的注釋著極為重要的意義，對(duì)包括外顯子測(cè)序（更多內(nèi)容請(qǐng)看外顯子測(cè)序課程），GWAS，醫(yī)學(xué)研究，進(jìn)化及群體遺傳分析等在內(nèi)的領(lǐng)域都有重要價(jià)值。對(duì)人類基因組基因數(shù)目的估算也在接下來(lái)的幾十年間令各國(guó)學(xué)者趨之若鶩。

1990年，來(lái)自美國(guó)國(guó)家健康中心（NIH）和美國(guó)能源部（DOE）的在人類基因組項(xiàng)目報(bào)告中進(jìn)行了另一次計(jì)算，作者認(rèn)為每個(gè)基因的長(zhǎng)度大概是3萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，且認(rèn)為非編碼區(qū)的長(zhǎng)度可以忽略。最終，作者們得到的結(jié)論是10萬(wàn)個(gè)基因。 

后面，又有多篇paper對(duì)人類基因組的數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果大概是5萬(wàn)-10萬(wàn)個(gè)基因之間(3-5)。2000年6月，來(lái)自TIGR（The Institute for Genomic Research）的幾位科學(xué)家通過(guò)對(duì)于EST序列的分析和新算法的設(shè)計(jì)，將這一數(shù)字提高到了12萬(wàn)(6)。殊不知，這也是人類對(duì)于自己基因數(shù)目的最后一次超過(guò)10萬(wàn)的估計(jì)。僅半年后，這篇文章的作者們就扇了自己的臉——但沒(méi)刪自己的論文——他們通過(guò)correction的形式修改了自己的結(jié)論，將預(yù)測(cè)結(jié)果縮小到56,960 ~ 81,273。

2001年，人類基因組測(cè)序——生物界的阿波羅登月計(jì)劃——在激烈的競(jìng)爭(zhēng)和全世界人民的關(guān)注下完成。之所以有競(jìng)爭(zhēng)，是因?yàn)橛袃杉覉F(tuán)隊(duì)獨(dú)立地展開了對(duì)人類基因組的測(cè)序。一支是包括我國(guó)學(xué)者在內(nèi)來(lái)自六個(gè)國(guó)家的國(guó)際合作項(xiàng)目，他們發(fā)表在Nature上的文章預(yù)測(cè)人類基因組含有3萬(wàn)~4萬(wàn)個(gè)基因(7)。另一邊廂，特立獨(dú)行的科學(xué)狂人克雷格·文特爾（J. Craig Ventor）由于所提出的鳥槍法（shotgun）思路不被國(guó)際合作組織采納，干脆另立門戶于1998年成立賽雷拉公司（Celera Genomics）槍挑六國(guó)聯(lián)軍，并迎頭趕上（文章同時(shí)刊發(fā)在Science上），最后得到的人類基因組大小為26,588“高可信度”（筆者注）加~12000弱支持度（week supporting evidence）基因。這兩個(gè)結(jié)果，無(wú)論哪一個(gè)，都讓人類對(duì)自己基因數(shù)目有了重新認(rèn)識(shí)：它遠(yuǎn)比人類早前的想象要小。

2004年，國(guó)際合作團(tuán)隊(duì)對(duì)人類基因組序列進(jìn)行了一次重要更新，將自己之前的預(yù)測(cè)由3-4萬(wàn)縮小到2-2.5萬(wàn)(8)。人們驚訝地發(fā)現(xiàn)，自己的基因竟然少過(guò)當(dāng)時(shí)剛剛完成測(cè)序的模式植物、擬南芥（Arabidopsis thaliana）——一種連運(yùn)動(dòng)功能都不具備的野草，也同分類學(xué)上被人類歸為低等動(dòng)物、大小僅1-2毫米的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）相差不多。生物學(xué)家曾經(jīng)認(rèn)為生物的復(fù)雜性和基因數(shù)目成正比，但在如山的鐵證面前，自詡為萬(wàn)物靈長(zhǎng)的人類要改變下自己的思維了。

后來(lái)的研究將人的基因數(shù)繼續(xù)縮小。2009年，人類對(duì)于自己的認(rèn)識(shí)達(dá)到了最為“謙卑”的狀態(tài)(9)——Mammalian Gene Collection團(tuán)隊(duì)稱人類基因組只有18877個(gè)基因(10)。不過(guò)好在到2017年底，NCBI的refseq數(shù)據(jù)庫(kù)中的最新版本的人類基因組注釋還是讓人基因組的基因數(shù)目突破了20000大關(guān)（20,054個(gè)蛋白編碼基因）。而在另一家常用的數(shù)據(jù)庫(kù)Gencode里，注釋了19817個(gè)基因(11)。

5月29日，享有Bowtie之父美譽(yù)的著名生物信息學(xué)家Steven Salzberg在bioRxiv生物學(xué)預(yù)印本服務(wù)器上發(fā)布了自己團(tuán)隊(duì)的最新成果：通過(guò)對(duì)9,795個(gè)RNA-seq實(shí)驗(yàn)結(jié)果的整合、分析，對(duì)人類基因組進(jìn)行了重新的注釋。這項(xiàng)成果實(shí)際上也是GTEx項(xiàng)目Genotype-Tissue Expression Project）的一個(gè)組成部分。

Btw：Salzberg，這位來(lái)自約翰霍普金斯大學(xué)的科學(xué)家是開放科學(xué)（open science）的忠實(shí)擁躉，近期就有大量manuscript投放到bioRxiv上，這一點(diǎn)在生信人早前的文章里也有報(bào)道（水熊蟲基因組烏龍事件的意義）。

作者采用的分析方法如下圖所示，其中用到的好幾個(gè)軟件都打著“Made in Salzberg Lab”的標(biāo)簽。

圖片來(lái)自(11)，版權(quán)CC-BY4.0

作者首先對(duì)收集得到的近10000個(gè)RNA-seq樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝，得到了30,467,424個(gè)轉(zhuǎn)錄本（transcript）。作者用一些列條件定義了protein coding gene，包括TPM閾值，ORF長(zhǎng)度、在其他生物種有無(wú)BLAST hit等。通過(guò)和目前人類基因組注釋的比較，作者發(fā)現(xiàn)了1,178個(gè)新的蛋白基因。加上和Refseq有overlap的轉(zhuǎn)錄本，作者們最終得到21,232個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因。作者們接下來(lái)對(duì)refseq里面注釋的15,779個(gè)長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行了“質(zhì)量檢驗(yàn)”。作者進(jìn)行了ORF預(yù)測(cè)，截取含有較長(zhǎng)ORF的lncRNA基因，對(duì)它們?cè)谄渌锓N中進(jìn)行BLAST搜索，如果達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)（E-value of 10-15，75% length）則認(rèn)為是潛在的protein coding gene。又經(jīng)過(guò)其他一些檢測(cè)之后，作者最終得到了21306個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因。

對(duì)沒(méi)有比對(duì)到編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本，作者把它們歸為非編碼RNA。作者找到了3,819個(gè)lncRNA 基因位點(diǎn)（gene locus）。其中，超過(guò)三分之一是反義（antisense）轉(zhuǎn)錄本，很多來(lái)自內(nèi)含子。把這些lncRNA和之前發(fā)現(xiàn)的lncRNA加起來(lái)，作者最終得到18,484個(gè)lncRNA。再加上其他各種非編碼RNA，最終非編碼RNA的總數(shù)是21856。

作者還分析了可變剪切的情況。每個(gè)蛋白基因平均含12.5個(gè)isoform，而lncRNA只有2.6個(gè)。

借助來(lái)自不同組織器官的豐富的RNA-seq樣本，作者用DESeq2對(duì)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。Breast成為protein-coding gene男女差異最大的器官。

圖片來(lái)自(11)，CC-BY4.0

而testis則擁有最多上調(diào)表達(dá)的編碼蛋白的基因。

圖片來(lái)自(11)，CC-BY4.0

最后，需要說(shuō)明的是，基因的定義是有爭(zhēng)議的話題。人們起初認(rèn)為能表達(dá)的就是基因，但后來(lái)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了廣泛的非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，而其中的很多轉(zhuǎn)錄本可能只是轉(zhuǎn)錄噪聲（transcription noise）。這篇preprint里，作者們以轉(zhuǎn)錄證據(jù)為起點(diǎn)并試圖去除這些噪聲轉(zhuǎn)錄本，再結(jié)合進(jìn)化證據(jù)，也就是說(shuō)基因要在不同物種中有一定保守性，且在不通個(gè)體中都可以看到轉(zhuǎn)錄（作者稱為reproductivity）。基于以上三點(diǎn)，作者在已有的基因組注釋的基礎(chǔ)上對(duì)人類基因組進(jìn)行了新的注釋。

雖然關(guān)于人類到底有多少（編碼蛋白）基因的爭(zhēng)論可以說(shuō)暫告段落，但科學(xué)家們還在對(duì)更多與此相關(guān)的問(wèn)題進(jìn)行著火熱的研究。一方面，RNA科學(xué)家雄心勃勃地拓展著lncRNA的版圖；而另一方面，對(duì)于已知基因功能的解讀還有漫漫長(zhǎng)路。 

圖片來(lái)源：https:///academy/lesson/what-are-genes-definition-types-function.html

引文

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10. Team MGCP, Temple G, Gerhard DS, Rasooly R, Feingold EA, Good PJ, et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Res. 2009;19(12):2324-33.

11. Pertea M, Shumate A, Pertea G, Varabyou A, Chang Y-C, Madugundu AK, et al. Thousands of large-scale RNA sequencing experiments yield a comprehensive new human gene list and reveal extensive transcriptional noise. bioRxiv. 2018.

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