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Genentech（基因泰克）前年上線了一檔評價很高的電臺節(jié)目，叫做Two Scientists Walk into a Bar（兩個科學(xué)家走進(jìn)一家酒吧），該電臺的節(jié)目內(nèi)容涉及基礎(chǔ)生物學(xué)、化學(xué)、腫瘤免疫藥物開發(fā)、臨床實驗設(shè)計等多個領(lǐng)域，是一檔少見的高品質(zhì)科普節(jié)目。 電臺的主播是基因泰克腫瘤免疫產(chǎn)品開發(fā)部的首席科學(xué)家Jane Grogan，而節(jié)目的錄制地點是在一家酒吧。Grogan會邀請各個領(lǐng)域的科學(xué)家來討論炎癥、疼痛、癌癥等大眾關(guān)注度比較高的話題。Grogan有些奇怪的澳大利亞口音，加上酒吧里觥籌交錯的背景音，非常適合我這種失眠癥患者在睡不著的時候用來催眠。可能很多人好奇Grogan為何會把這檔節(jié)目的錄制地點選在一家酒吧，其實這是為了紀(jì)念基因泰克的兩位創(chuàng)始人Boyer與Swanson的相遇。 重組DNA技術(shù) 1968年冬天，Paul Berg結(jié)束了11個月的長假回到斯坦福大學(xué)。Berg是一名生物化學(xué)家，他在前半生的職業(yè)生涯里一直專注于蛋白質(zhì)合成研究，但在索爾克研究所進(jìn)行學(xué)術(shù)休假（sabbatical）的那11個月，他開始重新思考今后的研究方向。在這段時間里，Berg與索爾克研究所的病毒學(xué)家Renato Dulbecco一同進(jìn)行動物病毒研究，他花了很長時間思考基因和病毒，思考遺傳信息是如何傳遞的。 病毒的結(jié)構(gòu)比較簡單，通常只包含攜帶遺傳信息的核酸以及包裹核酸的衣殼。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后會脫去外殼使遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞，并使用宿主細(xì)胞作為基因復(fù)制和表達(dá)的工廠來制造新的外殼和遺傳物質(zhì)，以此產(chǎn)生數(shù)以百萬計的新病毒。而Berg卻對其中的一種病毒非常感興趣: 猴病毒40 (SV40)。 SV40的基因組大小只有人類基因組的六十萬分之一。人類大約有2萬個基因，SV40只有7個基因。與其他很多病毒不同的是，SV40可以與很多宿主細(xì)胞和平相處。有些病毒在感染宿主細(xì)胞之后可以復(fù)制自身產(chǎn)生數(shù)百萬計的新病毒，并最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡，而SV40可以將自身DNA插入宿主細(xì)胞的基因組 (雖然這并不是SV40獨有的特征)，如果不存在特定的激活信號，這些插入宿主細(xì)胞基因組的基因會一直處于休眠狀態(tài)。 Berg由此認(rèn)為SV40是傳遞人遞遺傳信息的理想載體，他覺得如果能夠?qū)⑼庠葱曰蜓b載入SV40基因組，那么這個外源性基因?qū)⒂锌赡茈S著病毒基因組一同被插入到人細(xì)胞的基因組之中，從而修改宿主細(xì)胞的遺傳信息。毫無疑問，如果他的設(shè)想能夠?qū)崿F(xiàn)的話，將會開啟遺傳學(xué)領(lǐng)域的新篇章。 Berg明白實現(xiàn)這一目標(biāo)并非易事，他面對的第一個技術(shù)障礙便是如何將外源基因插入病毒的基因組，也就是說他必須找到能夠人工構(gòu)建病毒基因與外源基因嵌合體的方法。 與人類細(xì)胞內(nèi)DNA的線性結(jié)構(gòu)不同，SV40的DNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。病毒在入侵進(jìn)入宿主細(xì)胞之后，環(huán)狀的DNA會打開形成線性結(jié)構(gòu)，在環(huán)狀DNA被打開之后才能將病毒DNA插入到宿主細(xì)胞基因組之中。Berg認(rèn)為，如果要向SV40的DNA中插入外源基因，需要先打開SV40的環(huán)狀DNA，之后再將DNA片段的末端連接到一起重新形成環(huán)狀DNA，接下來的工作則交給病毒自己來完成，病毒將攜帶外源基因感染宿主細(xì)胞，并將該外源DNA片段插入到宿主細(xì)胞的基因組中。 其實Berg并不是唯一一個思考過如何打開病毒環(huán)狀DNA并插入外源基因的科學(xué)家。1969年，同樣是在斯坦福大學(xué)，另一課題組的研究生Peter Lobban曾寫過一篇研究生中期考核研究計劃，他提議使用類似的基因操作來修改另一種病毒的遺傳信息。 Lobban的本科在麻省理工學(xué)院（MIT）就讀，而且受MIT的影響，他看起來更像是一名工程師。Lobban在研究計劃中直白地寫到，細(xì)胞中的基因與建筑中使用的鋼梁并沒有什么差別，同樣可以被改造以適應(yīng)人的各種需求，但最重要的是如何找到改造基因的工具。那時Lobban已經(jīng)在導(dǎo)師Dale Kaiser的指導(dǎo)下開始了實驗研究，嘗試使用生物化學(xué)實驗室的常用酶將基因從一個DNA分子轉(zhuǎn)移到另一個DNA分子上。 實際上Berg和Lobban都已經(jīng)意識到不應(yīng)該把SV40看做是一個病毒，而是應(yīng)該把它當(dāng)做化合物來處理：他們需要做的是通過一系列的生化反應(yīng)將基因插入到SV40的基因組中。但是Berg知道他首先需要找到一個能夠剪切環(huán)狀DNA的酶，其次是得到另一種酶將外源DNA與SV40的DNA相連。 但是去哪里尋找這些能夠剪切和連接DNA的酶呢？或許從細(xì)菌中尋找是一個比較明智的選擇。從上世紀(jì)60年代開始，科研人員就已經(jīng)開始嘗試從細(xì)菌中純化出能夠在體外對游離DNA進(jìn)行連接的酶。理論上來講，任何細(xì)胞內(nèi)都應(yīng)該存在這種類型的酶，細(xì)胞復(fù)制過程（Okazaki片段連接）以及DNA損傷的修復(fù)過程都需要這種酶的參與。 DNA在損傷之后可能會產(chǎn)生斷裂，而在修復(fù)的過程中細(xì)胞需要特定的酶將斷裂的DNA片段重新連接（DNA損傷修復(fù)過程也是一些抗腫瘤藥物的作用靶標(biāo)，比如PARP抑制劑，見：新藥研發(fā)有多難？看PARP抑制劑四十年開發(fā)沉浮史）。連接酶 （ligase）就是參與上述過程的一種酶，它能夠?qū)NA骨架斷裂形成的兩個片段重新連接，從而恢復(fù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。 但是DNA剪切酶卻不太容易找到。幾乎所有的細(xì)胞都存在DNA連接酶的需求，但是一般而言細(xì)胞內(nèi)并不需要剪切酶來剪切DNA。不過有一些生物的細(xì)胞內(nèi)卻存在這樣的酶，在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的惡劣環(huán)境中生長的細(xì)菌和病毒，由于相互之間的競爭異常激烈，使細(xì)菌進(jìn)化出一套能夠剪切入侵病毒DNA的酶，作為自身防御的武器以抵抗病毒的入侵（其實這也是部分細(xì)菌免疫功能的基礎(chǔ)，另一種細(xì)菌的適應(yīng)性免疫是CRISPR系統(tǒng)，這部分內(nèi)容可以參考筆者關(guān)于CRISPR的科普文章，見：深度長文：為什么CRISPR必須拿諾獎？（上））。 這些細(xì)菌可以利用DNA剪切酶來剪切入侵病毒的DNA，這種酶被稱為限制性內(nèi)切酶 (限制性是指他們能夠識別DNA的特定序列，只在特定位點剪切DNA雙螺旋，而這種限制性至關(guān)重要，如果無法實現(xiàn)特異性剪切的話，這類酶可能會影響自身DNA，從而產(chǎn)生DNA損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)。 以上這兩種酶正是Berg實驗的基礎(chǔ)。Berg非常清楚這項技術(shù)的應(yīng)用價值：基因可以通過相互連接進(jìn)行重組，這些基因可以被修改，他也可以引入突變的基因，可以使基因在不同的物種之間轉(zhuǎn)移；一個青蛙的基因可以被插入到病毒基因組中，之后再被引入到人的基因組之中。而人的基因也可以以類似的方式被引入到細(xì)菌的基因組中。如果這項技術(shù)足夠成熟的話，人們就有可能非常自由地操控遺傳物質(zhì)。雖然重組DNA技術(shù)所使用的實驗操作、構(gòu)建重組DNA所使用的酶以及各種試劑均不是全新的，但是這項技術(shù)的創(chuàng)新之處在于DNA的重組，將DNA進(jìn)行剪切和重新連接。 1970年冬天，Berg和他所在實驗室的博士后David Jackson開始了第一次嘗試：剪切和連接兩個DNA片段。他們當(dāng)時的實驗過程非常繁瑣，Berg曾把這個實驗形容成生物化學(xué)家的噩夢。他們首先需要純化DNA，將DNA與酶混合，之后進(jìn)行低溫柱層析純化，而且他們需要不斷地重復(fù)以上操作以優(yōu)化生化反應(yīng)條件。問題在于，他們使用的剪切酶并不高效，產(chǎn)率非常低。 盡管存在技術(shù)上的種種限制，Berg和Jackson最終還是成功將SV40的整個基因組與λ噬菌體的一個DNA片段以及來源于大腸桿菌的三個基因進(jìn)行了連接。SV40和λ噬菌體都是病毒，但它們之間存在著巨大的差異，大腸桿菌與SV40相比則是完全不同的生物。Berg和Jackson成功地將這些來源于不同生物的DNA組合到了一起。Berg決定將這個雜合的DNA稱為重組DNA。 克服重重困難 在這之后Berg的實驗室來了一名新的研究生Janet Mertz。Mertz算得上難得一見的天才，與Lobban一樣在MIT就讀本科，獲得了工程和生物學(xué)兩個專業(yè)領(lǐng)域的學(xué)位。Mertz之所以選擇加入Berg實驗室是由于她對Jackson的重組DNA實驗感到非常好奇。 左: Paul Berg 右: Janet Mertz 不過Mertz一直在思考一個問題，如果顛倒一下Jackson的實驗?zāi)康臅a(chǎn)生什么樣的結(jié)果？Jackson的實驗操作是將大腸桿菌的遺傳物質(zhì)插入到SV40的基因組中，如果將SV40的基因片段插入大腸桿菌的基因組中呢？ 事實證明，將病毒的基因插入到大腸桿菌的基因組會產(chǎn)生一個巨大的技術(shù)優(yōu)勢。大腸桿菌攜帶一種被稱為質(zhì)粒的小型DNA，與SV40基因組相同，質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)同樣為環(huán)狀，能夠在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制。Mertz意識到，如果將SV40的基因插入到大腸桿菌的質(zhì)粒中，那么她將有可能將大腸桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)橥庠椿驈?fù)制的工廠。隨著大腸桿菌的增殖，大腸桿菌胞內(nèi)的質(zhì)粒也會隨之?dāng)U增，從而產(chǎn)生大量的外源DNA克隆。 1972年6月，Mertz離開斯坦福前往紐約的冷泉港參加動物細(xì)胞和病毒培訓(xùn)課程，這項課程要求學(xué)生針對自己未來的研究計劃做簡單報告。在報告中Mertz解釋了她的研究計劃：構(gòu)建SV40和大腸桿菌DNA的雜合體，并使其能夠隨著大腸桿菌的增殖不斷擴(kuò)增。研究生的研究課題一般不會引起專家們的興趣，但當(dāng)Mertz結(jié)束報告的時候，大家開始意識到這不是一場簡單的學(xué)術(shù)報告，先是一段長時間的沉默，緊接著導(dǎo)師和學(xué)生們的問題如潮水般涌來——你有沒有想過構(gòu)建DNA雜合體的風(fēng)險？這樣做會不會對人類產(chǎn)生危害？有沒有考慮過該項技術(shù)帶來的倫理問題？ 在聽完Mertz的報告之后，病毒學(xué)家Robert Pollack立即與Berg通話，跟他討論重組DNA的技術(shù)風(fēng)險。其實Berg和Mertz的實驗確實存在一個極為重要的風(fēng)險因素：SV40能夠誘導(dǎo)倉鼠細(xì)胞突變形成腫瘤。 雖然截止目前仍然沒有可靠證據(jù)表明SV40可能誘發(fā)人類細(xì)胞癌變，但在上世紀(jì)70年代，科學(xué)家們并不清楚該病毒的風(fēng)險。這確實是一個值得慎重考慮的問題，筆者在之前的基因療法的文章中詳細(xì)介紹過這一風(fēng)險，由于某些類型病毒的基因組插入位點比較特殊，會激活原癌基因誘發(fā)病人產(chǎn)生白血?。ㄒ姡?/span>基因療法的三十年風(fēng)雨上市之路）。 除此之外，由于大腸桿菌能夠在人類的腸道生存，如果Mertz和Berg真的成功構(gòu)建了攜帶SV40外源基因的大腸桿菌雜合DNA，如果SV40真的如科學(xué)家所擔(dān)心的那樣能夠誘發(fā)人細(xì)胞癌變，那么這種攜帶重組DNA的大腸桿菌是不是真的會誘發(fā)人細(xì)胞癌變，引發(fā)一場災(zāi)難呢？ 此后的幾周時間，Berg開始重新思考該項技術(shù)的風(fēng)險。但他仍然覺得Pollack的擔(dān)心是多余的。這項實驗只是在相對封閉的實驗室進(jìn)行，當(dāng)時也沒有證據(jù)表明SV40能夠誘發(fā)人類細(xì)胞癌變。實際上科研人員在實驗室工作的過程中也經(jīng)常被SV40病毒感染，但從沒有報道過該病毒引發(fā)癌癥的案例報道。為了應(yīng)對外界的質(zhì)疑，Berg甚至提出喝下他培養(yǎng)的SV40病毒以證明該病毒不存在致癌風(fēng)險。 盡管Berg相信SV40的安全性并不存在問題，他也不得不小心應(yīng)對外界的質(zhì)疑。他咨詢了一些權(quán)威腫瘤生物學(xué)家和微生物學(xué)家的意見，讓他們對風(fēng)險進(jìn)行評估。Dulbecco也對SV40充滿信心，但是科學(xué)家真的能夠準(zhǔn)確預(yù)測一項技術(shù)的未知風(fēng)險嗎？Berg十分清楚，對于任何一位科學(xué)家而言，科研過程中的判斷失誤以及實驗結(jié)果預(yù)測失敗是十分平常的事情。但這一次與以往的科學(xué)研究不同，如果他關(guān)于SV40危害性的預(yù)測錯誤，那么該項技術(shù)所產(chǎn)生的災(zāi)難性后果必將是他無法承受的。 既然無法完全確定風(fēng)險，Berg決定采取折中的辦法，只對游離DNA進(jìn)行操作，不將雜合DNA引入活細(xì)胞之中，以此避免誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的風(fēng)險。而此時的Mertz卻給了Berg一個很大的驚喜，她的實驗迎來了一個重大突破。此前Berg和Jackson的剪切和連接DNA需要6步操作，極為繁瑣。但Mertz發(fā)現(xiàn)了一條捷徑——使用EcoRI能夠?qū)⒓羟泻瓦B接DNA的步驟減少為兩步，從而使該實驗變得異常高效。這種酶是加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的微生物學(xué)家Herb Boyer提供的。 Boyer于1936年出生于賓夕法尼亞，從小便對生物學(xué)情有獨鐘，沃森和克里克也是他青年時期的偶像。1966年Boyer以助理教授身份加入了UCSF，此后便一直專注于純化DNA剪切酶。 1972年11月，Berg還在艱難權(quán)衡病毒-細(xì)菌雜合體的風(fēng)險，此時的Boyer已前往夏威夷參加當(dāng)年的微生物學(xué)會議。在結(jié)束上午漫長的會議報告之后，Boyer跑到了夏威夷的海灘享受甜美的午后時光。也是在那天傍晚，Boyer遇見了斯坦福大學(xué)的Stanley Cohen。 Cohen是質(zhì)粒領(lǐng)域的專家，此前Boyer就知道這個人，也讀過Cohen的文章，但從沒有當(dāng)面見過他。晚餐結(jié)束之后，Boyer、Cohen以及另一位微生物學(xué)家Stan Falkow漫步于夏威夷的威基基海灘，討論著質(zhì)粒以及嵌合DNA。Boyer和Cohen都知道Berg的重組DNA研究，Cohen也知道Berg實驗室的研究生Mertz正在斯坦福大學(xué)的微生物實驗室輪轉(zhuǎn)，學(xué)習(xí)將嵌合DNA轉(zhuǎn)移到大腸桿菌胞內(nèi)的技術(shù)。 他們的討論轉(zhuǎn)向了Cohen的工作，Cohen已經(jīng)成功分離出一些大腸桿菌質(zhì)粒，而且他已經(jīng)能夠非常高效地純化其中某些類型的質(zhì)粒，能夠方便地使質(zhì)粒在大腸桿菌種系之間轉(zhuǎn)移，而且他發(fā)現(xiàn)其中的一些質(zhì)粒攜帶某些抗生素（例如四環(huán)素和青霉素) 的抗性基因。 如果將抗生素抗性基因從質(zhì)粒中剪切下來，轉(zhuǎn)移到另一質(zhì)粒上會怎樣呢？是不是能夠使這些攜帶抗性基因質(zhì)粒的大腸桿菌獲得抗生素抗性，從而能夠在抗生素的環(huán)境中存活，而不攜帶該質(zhì)粒的大腸桿菌則被抗生素殺死？ 這一靈光乍現(xiàn)的想法猶如暗夜中的霓虹燈，照亮了暗夜中的海灘。另外兩人也意識到了這一想法的價值，因為在Berg和Jackson的實驗過程中并沒有找到合適的辦法鑒別哪些細(xì)菌或者病毒獲得了外源性的DNA。而Cohen的那些攜帶抗生素抗性的質(zhì)粒卻能夠高效的鑒別重組的DNA，因為只有獲得外源DNA (抗生素抗性基因) 的大腸桿菌才能夠在具有抗生素的環(huán)境中生存，以此便能夠驗證是否成功構(gòu)建了重組DNA。 Cohen擔(dān)心的是，Berg和Jackson的實驗中有另一個很嚴(yán)重的問題——構(gòu)建嵌合DNA的效率太低。如果構(gòu)建雜合DNA的成功率只有百萬分之一的話，即使后期有再好的篩選系統(tǒng)也很難將成功構(gòu)建的重組DNA篩選出來。然而Boyer的EcoRI很好的解決了這一問題，Mertz已經(jīng)成功優(yōu)化了DNA雜合體的構(gòu)建過程。 之后是漫長的沉默，但他們的思緒卻沒有停止。Boyer已經(jīng)能夠高效的純化用于構(gòu)建雜合DNA的限制性內(nèi)切酶，Cohen已經(jīng)能夠分離出合適的質(zhì)粒。構(gòu)建重組DNA的實驗看起來已經(jīng)非常簡單了，似乎只要一個下午的時間就能夠完成實驗：將被EcoRI剪切的質(zhì)粒DNA重新連接之后，可能會有一部分會質(zhì)粒能夠形成重組質(zhì)粒DNA分子，之后利用抗生素抗性則能夠篩選成功獲得外源基因的大腸桿菌，隨著大腸桿菌的增殖外源基因也會隨之?dāng)U增，從而不斷克隆重組DNA。Cohen小聲說道：也就是說 . . . . . . 。還沒等他說完Boyer便說道：對，這應(yīng)該是可行的。 其實Cohen和Boyer的實驗還有另一個非常重要優(yōu)勢：該實驗的生物危害性爭議更小。與Berg和Mertz的病毒-細(xì)菌雜合實驗不同，Cohen和Boyer的雜合DNA只包含細(xì)菌的基因，因此Cohen和Boyer認(rèn)為至少理論上來講他們的實驗生物危害更小。 左: Stanley Cohen； 右: Herbert Boyer 1972年冬天以及1973年的春天，Boyer和Cohen一直在忙碌地進(jìn)行構(gòu)造DNA雜合體的實驗。此時的Berg和Mertz雖然已經(jīng)知道同一學(xué)校的Cohen在進(jìn)行重組DNA的研究，但他們依然沒有進(jìn)行將嵌合DNA導(dǎo)入活細(xì)胞的實驗。 1973年2月，Boyer和Cohen已經(jīng)開始將嵌合DNA導(dǎo)入細(xì)胞。他們使用限制性內(nèi)切酶對兩種細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行剪切，并將特定遺傳信息從一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一質(zhì)粒上，之后使用連接酶將DNA片段完全連接形成嵌合體。該嵌合體在導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞之后對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌在培養(yǎng)過夜之后胞內(nèi)的外源基因會隨著細(xì)菌的增殖不斷被復(fù)制。他們的實驗成功了，一項足以改變世界的新技術(shù)也就此誕生。 走進(jìn)一家酒吧 一開始的時候，重組DNA技術(shù)只局限于學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)的實驗室，只有生物化學(xué)家們才會關(guān)注這項技術(shù)，但是不久之后便引起了媒體的關(guān)注。1974年5月，舊金山紀(jì)事報對Cohen進(jìn)行了專訪，并且在文章中重點介紹了重組DNA技術(shù)的價值，文章中說基因工程細(xì)菌未來將可能成為生物工廠，用來生產(chǎn)藥物和小分子化合物。很快紐約時報等其他媒體開始跟進(jìn)報道基因克隆技術(shù)。 斯坦福大學(xué)專利事務(wù)辦公室的Niels Reimers從報紙上讀到了Cohen和Boyer的報道后立即被這項研究的巨大潛力吸引。Reimers主動找到了Cohen和Boyer，讓他們聯(lián)合申請關(guān)于基因克隆的技術(shù)專利（斯坦福大學(xué)和UCSF也持有專利權(quán)）。Cohen和Boyer對Reimers的舉動都感到很驚訝，因為他們從來沒想過重組DNA技術(shù)能夠申請專利，也沒有想到這項技術(shù)可能具有極大的商業(yè)價值。 1974年冬天，雖然Cohen和Boyer仍然很懷疑重組DNA技術(shù)申請專利的可能性，但還是在Reimers的幫助下提交了專利申請書。兩人申請專利的消息很快傳到了其他科學(xué)家的耳朵里。 Berg對此感到非常氣憤，覺得Cohen和Boyer專利中的權(quán)利要求太荒唐，因為該專利的權(quán)利要求中聲明他們擁有使用這項技術(shù)克隆所有DNA的商業(yè)所有權(quán)。Berg覺得他們申請專利的行為簡直可笑，這項由公共經(jīng)費支持而誕生的技術(shù)，怎么可以通過專利申請使利益私有化？或許對于當(dāng)時的很多科學(xué)家而言，這樣的行為確實讓他們很難理解。 1975年秋天，專利申請的事務(wù)尚未處理完畢，Cohen和Boyer在科學(xué)的道路上卻開始分道揚(yáng)鑣。他們之間的合作一直非常愉快，5年時間內(nèi)他們合作發(fā)表了11篇重要論文。但是隨著時間的推移，他們的興趣卻越來越不同。Cohen此后前往加州的一家生物公司Cetus擔(dān)任顧問（Cetus應(yīng)該是第一家生物工程為專業(yè)背景的公司，但一般認(rèn)為基因泰克才是歷史上第一家生物技術(shù)公司)，而Boyer則回到了UCSF的實驗室繼續(xù)專注于重組DNA的實驗研究。 1975年冬天，Boyer接到一位年輕的風(fēng)險投資人Robert Swanson打來的電話，Swanson希望Boyer能夠安排一次會面。Swanson雖然不是科學(xué)家，但他從小就很喜歡讀科普雜志，看科幻電影，而且他也聽說過這項叫做重組DNA的新技術(shù)。Swanson對新技術(shù)有種天生的敏銳，盡管他不太懂生物學(xué)，但他依然感覺重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)能夠完全改變?nèi)藗儗蚝瓦z傳學(xué)的思考方式。 Swanson從Asilomar會議手冊中查找參會的人員名單，并篩選出基因克隆領(lǐng)域重要的科學(xué)家，并按首字母順序依次排列制成一份新的名單。在這份名單中Berg排在Boyer的前面，但Berg對于那些貿(mào)然給他辦公室打電話的投資人完全沒有耐心，直截了當(dāng)?shù)鼐芙恿薙wanson面談的請求。 Swanson并沒有灰心，他依照列表中的順序打給了Boyer。Boyer當(dāng)時正埋頭實驗，并沒有太多時間理會Swanson，但還是答應(yīng)抽出10分鐘的時間與他見面。 1976年1月，Swanson前往Boyer的實驗室與他會面。Swanson穿著整潔的黑色的西裝走進(jìn)了Boyer的實驗室，目光穿過堆積如山的試劑、培養(yǎng)皿以及各種儀器，終于見到了穿著皮背心和牛仔褲的科學(xué)家Boyer。 Boyer對Swanson并不了解，只知道他是一位風(fēng)險投資人，想與他基于重組DNA技術(shù)合作成立一家公司。如果Boyer當(dāng)時仔細(xì)調(diào)查一下這位風(fēng)險投資人的話，一定不會答應(yīng)Swanson見面的要求，因為Swanson此前幾乎所有的投資項目都失敗了，而且當(dāng)時正處于失業(yè)狀態(tài)，他租住在舊金山的一家破舊公寓里，開著一輛廉價的達(dá)特桑，午餐和晚餐只能用三明治果腹。盡管如此，Boyer和Swanson卻相談甚歡，他們顯然不滿足于原計劃的10分鐘面談時間。 左：Herbert Boyer；右：Robert Swanson 他們走進(jìn)學(xué)校附近位于Inner Sunset的一家酒吧，討論著重組DNA技術(shù)以及生物學(xué)的未來。Swanson提議成立一家公司，使用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)藥物。對于Boyer來說，這一想法確實很有吸引力，他的兒子有生長發(fā)育障礙，很早之前他就很清楚使用重組DNA技術(shù)有可能大量生產(chǎn)生長激素。但即使有想法又有什么用呢，沒有人愿意給自己的孩子注射那些從實驗室培養(yǎng)皿中獲得的細(xì)菌提取物。想要生產(chǎn)藥品，他必須成立一家新型的制藥公司，一家使用基因技術(shù)來生產(chǎn)藥物的公司。 3個小時的會談和幾杯啤酒之后，Swanson和Boyer達(dá)成了初步的協(xié)議。他們決定每人出資500美金用來支付公司成立所需的費用。之后Swanson寫了6頁的商業(yè)企劃書，找到了從前的雇主Kleiner Perkins，希望他的公司能夠投資50萬美金作為新公司的啟動資金。Perkins粗略看了一眼Swanson的企劃書，把金額削減至五分之一，也就是10萬美金。盡管這并不是一筆很大的投資，但幸運(yùn)的是Boyer和Swanson此時已經(jīng)擁有了一家新公司需要的所有東西，除了一款能夠上市的藥品以及新公司的名字。 這家公司能夠涉足的疾病領(lǐng)域其實很容易找，幾乎所有人都會首先想到利用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)胰島素。在重組DNA技術(shù)誕生的幾十年時間里，科研人員嘗試了很多策略人工合成胰島素，但胰島素的主要來源依然是粉碎的?；蜇i的內(nèi)臟。生產(chǎn)一公斤胰島素需要將近8000公斤的胰臟，這種提取方法即低效又昂貴。如果Boyer和Swanson能夠使用重組DNA技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)胰島素，那么這種方法不僅足以支撐這家新公司未來的發(fā)展，也會成為制藥行業(yè)歷史上的里程碑式事件。 至于公司的名字，Boyer拒絕了Swanson的提議: HerBob，因為這個名字聽起來的確很像美發(fā)沙龍。他提議使用GENetic ENgineering TECHnology的縮寫：Gen-en-tech。 胰島素還是生長抑素 1869年，柏林的醫(yī)學(xué)生Paul Langerhans通過顯微鏡觀察胰腺，發(fā)現(xiàn)胰腺上分布著由形態(tài)異常的細(xì)胞組成的小島，這些細(xì)胞群島后來被稱為朗格漢斯島，但是當(dāng)時并沒有人知道朗格漢斯島的生理功能。直到20多年后兩位外科醫(yī)生Oskar Minkowski和Josef von Mering通過手術(shù)切除了狗的胰腺才確定該器官的功能，他們還發(fā)現(xiàn)胰腺能夠通過分泌胰島素控制血糖。 胰島素功能的鑒定也迅速引發(fā)了純化胰島素的爭奪戰(zhàn)。盡管競爭激烈，但是直到20多年后科研人員才成功從動物中提取出了胰島素。1921年，Banting和Best從幾十斤牛胰腺中提取出了幾微克的胰島素，在將胰島素注射到患有糖尿病的兒童體內(nèi)之后，病人的血糖迅速恢復(fù)至正常水平，口渴和多尿的癥狀也有所減輕。雖然胰島素的藥效非常明顯，但是由于胰島素水溶性差，熱不穩(wěn)定，使提取過程變得異常艱難。 相比繁瑣的提取過程，Boyer合成胰島素的計劃聽起來似乎可能更高效。當(dāng)時還沒有人成功獲得包含胰島素基因的DNA片段，于是他決定通過化學(xué)從頭合成的方法合成編碼胰島素A鏈和B鏈的兩條DNA分子，并將DNA插入細(xì)菌的基因組使它們能夠合成人類胰島素。在這之后，他計劃將兩條肽鏈純化并運(yùn)用化學(xué)手段將兩條鏈連接，以此獲得人胰島素蛋白。 即使Boyer再有信心，他也不想從胰島素的合成開始這一嘗試。他希望首先合成一種結(jié)構(gòu)相對簡單和容易操作的蛋白，如果成功的話再去挑戰(zhàn)高難度的胰島素。Boyer思來想去，最終決定從生長抑素（somatostatin）開始。 與胰島素相同，生長抑素也是一種激素，但生長抑素的商業(yè)價值并沒有胰島素那么大，他的主要優(yōu)勢是分子量小。胰島素有兩條鏈51個氨基酸，而生長抑素只由14個氨基酸組成。為了從頭合成生長抑素基因，Boyer從洛杉磯的City of Hope醫(yī)院招聘了兩名化學(xué)家 Keiichi Itakura和Art Riggs，兩人都是DNA合成領(lǐng)域的專家。 然而Swanson卻強(qiáng)烈反對Boyer的計劃，他覺得合成生長抑素只會分散這家公司的注意力，他希望Boyer能夠直接嘗試合成胰島素。對他而言，基因泰克是一家由風(fēng)險投資撐起來的公司，只有幾間租來的辦公室和位于UCSF的微生物學(xué)實驗室，Boyer居然想聘請兩名化學(xué)家合成生長抑素的基因，這實在讓他無法接受。 Boyer最終還是說服了Swanson。其實Boyer和Swanson都很清楚他們時間非常緊迫，因為他們已經(jīng)了解到基因?qū)W領(lǐng)域的另外兩位大牛也加入了胰島素生物合成的戰(zhàn)爭之中。哈佛大學(xué)的Walter Gilbert是DNA合成領(lǐng)域的權(quán)威，他與Berg和Sanger一同獲得了1980年的諾貝爾化學(xué)獎。此時的他正領(lǐng)導(dǎo)一個實力強(qiáng)勁的團(tuán)隊運(yùn)用基因克隆技術(shù)合成胰島素。而在UCSF，也就是Boyer所在的學(xué)校，另一個團(tuán)隊也已經(jīng)開始嘗試使用重組DNA技術(shù)合成胰島素。那時的Boyer時時刻刻都在擔(dān)心，他每天都在害怕，害怕聽到他的對手Gilbert已經(jīng)首先合成胰島素的消息。 1977年夏天，Riggs和Itakura成功合成了生長抑素的DNA。該DNA片段被順利插入細(xì)菌的質(zhì)粒，細(xì)菌也成功被轉(zhuǎn)化，似乎這些細(xì)菌已經(jīng)準(zhǔn)備好合成生長抑素了。6月的時候，Boyer和Swanson飛往洛杉磯見證這最后的一刻。 那天早晨，整個團(tuán)隊聚集在Riggs實驗室，大家焦急地等待著實驗結(jié)果，以確定細(xì)菌是否真的能夠生產(chǎn)生長抑素。讓人遺憾的是，他們并沒有找到任何生長抑素的蹤跡。對于Swanson來說這的確是無法承受的消息，此時的他完全被擊垮了，第二天早晨因為嚴(yán)重消化不良被送往急診室。 科學(xué)家們雖然經(jīng)受了同樣的打擊，卻依然能夠冷靜地分析實驗失敗的原因。Boyer毫無疑問是微生物學(xué)領(lǐng)域的專家，他有著幾十年的細(xì)菌實驗經(jīng)驗。他很清楚細(xì)菌完全有可能會消化掉自身產(chǎn)生的蛋白。說不定這些細(xì)菌能夠生產(chǎn)生長抑素，會不會是這些蛋白被細(xì)菌自身降解掉了呢？ 為了驗證這一假設(shè)，他決定將生長抑素的基因與該細(xì)菌的某些自身基因相連接，從而生產(chǎn)出同時具有兩種類型蛋白組分的復(fù)合蛋白，之后再將兩個蛋白剪切就能夠得到生長抑素。采用這種方式的話細(xì)菌就會把生產(chǎn)的雜合蛋白識別為自身的蛋白，生長抑素卻不會被降解。 不過合成這個雜合體DNA又花了兩個多月時間。1977年8月，Boyer團(tuán)隊又重新聚在Riggs的實驗室等待著最后的結(jié)果。Swanson焦慮的看著顯示器，他已經(jīng)緊張的無法喘息，他轉(zhuǎn)過頭去不敢看最后的實驗結(jié)果。不過這一次他們成功了，Itakura告訴Swanson，他們檢測到了生長抑素。 基因泰克的科學(xué)家們并沒有時間慶祝，他們立即開始了合成胰島素的項目。很顯然，當(dāng)時合成胰島素的競爭已經(jīng)異常激烈。此時的Boyer時常會聽到各種流言，有人說Gilbert課題組已經(jīng)從人細(xì)胞中克隆出了胰島素基因，已經(jīng)準(zhǔn)備好合成胰島素了。還有人說UCSF的課題組已經(jīng)合成出幾毫克的胰島素，正計劃進(jìn)行人體試驗。 是否生長抑素真的分散了基因泰克的注意力？Boyer和Swanson感到無比懊悔，他們認(rèn)為選擇首先合成生長抑素是個錯誤的選擇，使他們從胰島素合成的競爭中掉隊了。此時的Swanson由于過度焦慮又出現(xiàn)了嚴(yán)重的消化不良。 令所有人都沒有想到的是，正是那個被Boyer極其蔑視的Asilomar會議拯救了他們。Berg以及Mertz在首次合成嵌合DNA之后遭遇了外界的強(qiáng)烈質(zhì)疑，這些質(zhì)疑不僅包括對于SV40病毒危害性的恐懼，還包括對重組DNA技術(shù)本身所產(chǎn)生的倫理問題的擔(dān)憂。 1975年，Berg在Asilomar海灘的一個會議中心組織了一次極具影響力的會議，討論生物技術(shù)的危害性以及如何制定該領(lǐng)域管理規(guī)定。盡管Cohen和Boyer也參加了這次會議，但是Cohen對這次會議感到十分厭惡，Cohen在會議結(jié)束之后也拒絕在Asilomar會議協(xié)約上簽字 (但由于NIH的要求，Cohen必須遵守協(xié)約的要求)。 像Cohen實驗室以及大多數(shù)接受聯(lián)邦政府資助的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)實驗室一樣，哈佛大學(xué)的Gilbert實驗室也必須遵守Asilomar條約。這些條約對Gilbert的限制非常大，因為按照該條約的規(guī)定，他不可以分離人體基因并將該基因插入細(xì)菌基因組。 Riggs和Itakura在成功合成生長抑素之后決定采用化學(xué)合成的方法獲得胰島素DNA，而化學(xué)合成DNA并不受Asilomar條約的限制。而且基因泰克是從風(fēng)險投資公司獲得的資金支持，并未獲得過聯(lián)邦政府資助，自然也不受這些規(guī)定的約束。這些對Gilbert限制重重的條約對于基因泰克來說簡直是贏得胰島素合成之戰(zhàn)的法寶。 此時，位于舊金山的小隔間辦公室已經(jīng)無法滿足基因泰克的發(fā)展了，Swanson也開始在該城市尋找新的實驗室。1978年春天，在跑遍了灣區(qū)之后Swanson終于找到了一個合適的辦公和實驗研究地點，Boyer又招聘了幾名科學(xué)家，購買了新的儀器設(shè)備。 Boyer和Swanson并沒有順利找到胰島素的蹤跡，而Gilbert也不愿意再受Asilomar條約的限制，派遣了一支專業(yè)團(tuán)隊前往英國繼續(xù)進(jìn)行項目研究。UCSF的課題組也派遣了一名學(xué)生前往法國斯特拉斯堡的一家制藥公司，以期能夠盡快合成胰島素。 1978年夏天，Boyer聽聞Gilbert即將宣布他們的課題組成功分離了人胰島素基因。得知這一消息的Swanson再一次崩潰了。當(dāng)時的Gilbert并不知道其實他們的實驗出現(xiàn)了差錯，克隆得到的并不是人胰島素基因，而是小鼠胰島素基因。 就在Gilbert出現(xiàn)錯誤的間隙，基因泰克奮起直追。這是一場學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)與制藥公司之間的較量，其中一方擁有強(qiáng)大的學(xué)術(shù)背景，擁有頂尖的團(tuán)隊，卻被種種限制所束縛，而另一方雖然人員相對較少，但反應(yīng)迅速，游刃于各種繁雜的規(guī)定之間。 1978年5月，基因泰克的科學(xué)家團(tuán)隊終于在細(xì)菌中合成了胰島素的兩條肽鏈；7月，他們從細(xì)菌中純化出了包含兩條胰島素肽鏈的蛋白。8月初，他們剪切掉了連接的細(xì)菌蛋白，成功分離得到了胰島素的兩條肽鏈。1978年8月21日的晚上，Goeddel將兩條肽鏈成功的連接，第一次獲得了重組人胰島素。 是什么力量成就了基因泰克？是Swanson拉來的風(fēng)險投資，還是Cohen和Boyer的重組DNA技術(shù)？是與Gilbert爭奪戰(zhàn)中的偶然，還是技術(shù)發(fā)展到一定程度的必然？是由于Swanson敏銳的商業(yè)嗅覺，還是Boyer作為具有專業(yè)背景科學(xué)家的強(qiáng)勢？ 我想每個人心中都有自己的答案。 Jerry專欄 療法: 腫瘤免疫療法 | 基因療法 | RNA干擾 | CRISPR | 細(xì)胞療法 藥物: PARP抑制劑 | CETP抑制劑 | STING激動劑 | IDO抑制劑 |氘代藥物 公司/人物: Moderna | Vivek Ramaswamy |
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