1）通過在蛋白編碼基因上游啟動子區(qū)（桔）發(fā)生轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因（藍(lán)）的表達(dá)（如酵母中的SER3基因）。 2）通過抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因 （藍(lán)）表達(dá)（如小鼠中的p15AS）。 3）通過與蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫），進(jìn)而干擾mRNA的剪切，從而產(chǎn)生不同的剪切形式。 4）通過與 蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈（紫），進(jìn)一步在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA，調(diào)控基因的表達(dá)水平。 5）通過結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，lncRNA轉(zhuǎn)錄本（綠）能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性。 6）作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體。 7）通過結(jié)合到特定蛋白上，改變該蛋白的胞質(zhì)定位。 8）作為小分子RNA，如miRNA，piRNA的前體分子。
LncRNA的一般研究策略如圖2所示，其過程主要包括LncRNA篩選、LncRNA確定、表達(dá)分析、功能研究和表達(dá)調(diào)控。 1) LncRNA篩選通過lncRNA芯片或RNA-seq等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析；通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測lncRNA的靶基因；通過PCR或Northern Blot技術(shù)對候選lncRNA驗(yàn)證，確定其表達(dá)差異。QIAGEN RT2 lncRNA PCR Array通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，可同時(shí)對多個(gè)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病機(jī)制相關(guān)的lncRNA的表達(dá)進(jìn)行集成式篩選，為研究者提供靈敏而特異的lncRNA表達(dá)譜分析。也可用于對RNA-seq及芯片研究結(jié)果的驗(yàn)證。
(2) LncRNA全長克隆可以通過5' RACE獲取lncRNA 5'全長，3' RACE獲取lncRNA 3'全長，最終獲取完整的lncRNA序列。
(3) 表達(dá)分析細(xì)胞水平表達(dá)：在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測表達(dá)差異。 組織分布：檢測不同組織、不同階段表達(dá)特性。 表達(dá)水平動力學(xué)變化：比較不同處理?xiàng)l件下，如藥物處理、誘導(dǎo)處理下，表達(dá)水平差異。
(4) 功能研究功能獲得性研究：構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體。 功能缺失性研究：可通過siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，干預(yù)lncRNA后檢測其對疾病相關(guān)基因表達(dá)影響和對細(xì)胞表型如增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響。 可通過RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)錄因子：研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。 染色質(zhì)重塑：lncRNA表觀調(diào)控。 ceRNA機(jī)制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調(diào)控機(jī)制。 |
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