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五篇Science、Nature文章基因組編輯技術(shù)

 山峰云繞 2018-03-03



生物通報道  一種可利用導(dǎo)向RNA分子靶向裂解DNA的細(xì)菌酶,一直以來被用作為一種可編程工具,位點特異性修改從細(xì)菌、人類細(xì)胞到斑馬魚等生物及細(xì)胞的基因組。

在1987年的一篇論文中,日本大阪大學(xué)的研究人員報告了一項表面上微不足道的研究發(fā)現(xiàn)。他們在調(diào)查一種編碼堿性磷酸酶的細(xì)菌基因序列時,發(fā)現(xiàn)了鄰近的一個不同尋常的DNA片段,這一DNA片段中間是一段短直接重復(fù)核苷酸序列,兩側(cè)為短特異片段。他們當(dāng)時指出“這些序列的生物學(xué)意義尚不清楚”。在幾乎過去快30年后,這一最初看起來不起眼的研究發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在為簡易操控大量生物體的基因組打開了大門。

近期,《科學(xué)》(Science)和《自然生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)雜志上,接連發(fā)表了5篇研究論文,報告了研究人員現(xiàn)在稱之為CRISPR–Cas系統(tǒng)的這一細(xì)菌序列的應(yīng)用,它成為了基因組編輯的一個簡單通用工具。

隨著近幾十年來全基因組測序常規(guī)化,在很多的細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了包含CRISPR序列的區(qū)域和CRISPR相關(guān)(Cas)基因。發(fā)現(xiàn)這些短獨特序列能與病毒或質(zhì)粒DNA序列相匹配,表明CRISPR–Cas系統(tǒng)能夠編碼“適應(yīng)性”免疫系統(tǒng),提供特異防御對抗入侵者。隨后的遺傳和生物化學(xué)實驗證實了這一猜測,表明CRISPR–Cas允許檢測和防止移動遺傳元件。

盡管一些CRISPR–Cas系統(tǒng)需要多種蛋白才能發(fā)揮功能,在許多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的II型系統(tǒng)卻只需利用一種內(nèi)切核酸酶Cas9。該酶與導(dǎo)向RNA協(xié)同作用定位在PAMs保守序列限定的位點,裂解入侵DNA。為了形成功能性的DNA靶向復(fù)合物,Cas9需要兩種不同的RNA轉(zhuǎn)錄物,crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA )。然而,近期的研究表明,這樣的雙RNA可以重新裝配成一種單導(dǎo)向RNA (single-guide RNA,sgRNA),其包含的序列足以編程Cas9,介導(dǎo)靶DNA雙鏈斷裂。

新的研究論文表明,RNA導(dǎo)向Cas9可以在多種細(xì)胞和生物體中發(fā)揮功能,在特異位點裂解完整基因組。這一點使得它具有基因組編輯的潛能。當(dāng)借助于同源重組或是非同源末端連接,這些標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制修復(fù)雙鏈斷裂時,可以此修改修復(fù)位點的序列,或插入新的遺傳信息。

近期的三項研究證實RNA編程Cas9可以在人類細(xì)胞中發(fā)揮功能。美國哈佛-麻省理工Broad 研究所、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院和首爾大學(xué)的三個獨立研究小組,設(shè)計出了來自產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9酶版本,它能在人類細(xì)胞核中維持活性。研究人員還設(shè)計出了雙RNAs或 sgRNAs,它們包含著與人類靶DNA序列互補的20個核苷酸序列。當(dāng)研究人員在各種人類細(xì)胞系中表達(dá)這種“人源化” Cas9和導(dǎo)向RNAs時,他們觀察到靶DNA發(fā)生了預(yù)期的改變,介導(dǎo)了雙鏈斷裂及隨后的修復(fù)。這種基因打靶成功率高達(dá)38%,只伴隨有低水平的Cas9毒性。這種RNA導(dǎo)向Cas9還可有效觸發(fā)人類細(xì)胞中正常基因組位點的靶向性基因置換。

早先的研究發(fā)現(xiàn),單鏈RNA斷裂有利于同源重組,以及減少脫靶突變?;诖?,美國哈佛-麻省理工Broad 研究所和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員還對Cas9進(jìn)行測試。發(fā)現(xiàn)突變酶非同源末端連接效率較低,但同源重組觸發(fā)的基因置換和野生型內(nèi)切核酸酶一樣有效。兩個小組還進(jìn)一步證實了該系統(tǒng)在“多路”靶向中的功能;sgRNA編程Cas9可結(jié)合兩種不同的基因組序列,其表達(dá)可導(dǎo)致不止一個靶位點序列斷裂。此外,Broad 研究所的研究人員還證實單獨表達(dá)原來雙tracrRNA–crRNA組合中的兩個RNA元件,基因破壞效率能夠進(jìn)一步提高。這一研究發(fā)現(xiàn)表明改良sgRNAs或許可使它們更好地模擬雙RNA結(jié)構(gòu)。

除了這些在細(xì)胞系中獲得的研究結(jié)果,洛克菲勒大學(xué)的研究人員還利用RNA導(dǎo)向的Cas9操縱了完整生物體的基因組。他們證實通過在單細(xì)胞中采用不同的幾種導(dǎo)向RNA編程Cas9,可在細(xì)菌中使用這一系統(tǒng)修改多個位點。此外,麻省總醫(yī)院的研究人員證實將Cas9編碼mRNA和適當(dāng)?shù)膶?dǎo)向RNAs注入到單細(xì)胞期胚胎中,在所有測試胚胎中導(dǎo)致了10個位點中的8個發(fā)生了高頻率(24–59%)的靶向性插入和刪除。這些研究結(jié)果表明,RNA導(dǎo)向Cas9可能能夠用于操縱其他的多細(xì)胞生物,包括哺乳動物和植物。該技術(shù)另一個最讓人感到興奮的潛在應(yīng)用是,為生成人類疾病動物模型提供了一種簡單的方法。

利用RNA可編程Cas9進(jìn)行基因組操作,有望廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)、直接和多路干擾基因網(wǎng)絡(luò),體內(nèi)外靶向性基因治療。下一個挑戰(zhàn)將是分析和解決可能出現(xiàn)的脫靶效應(yīng),提高系統(tǒng)效率和特異性,擴(kuò)大應(yīng)用到其他生物體。就這方面而言,比較RNA編程Cas9與現(xiàn)有的基因編輯工具,包括大范圍核酸酶、ZFNs和TALENs將具有極重要的意義。除了基因組編輯,這一方法可為利用失活性Cas9導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄性基因沉默,或工程操作Cas9獲得轉(zhuǎn)錄激活等新功能提供了可能性。限制性酶和耐熱聚合酶等細(xì)菌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用,在過去徹底改變了分子生物學(xué)。有了RNA導(dǎo)向Cas9酶,細(xì)菌現(xiàn)在為我們提供了重新基因組序列信息的一個通用工具,其具有在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中改造基因組工程景觀的潛力。

(生物通:何嬙)

生物通推薦原文索引:

Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science: Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823 DOI: 10.1126/science.1231143

RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.Science: Vol. 339 no. 6121 pp. 823-826 DOI: 10.1126/science.1232033

A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.Nature Biotechnology. Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nbt.2517

RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nature Biotechnology.Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nbt.2508

Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.Nature Biotechnology.Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nbt.2501

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