|
20世紀(jì)80年代初，胚胎干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的成功為基因敲除奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動物細(xì)胞中同源重組(homology recombination, HR)的存在為基因敲除奠定了理論基礎(chǔ)[2]。為了編輯基因，傳統(tǒng)的靶向特定等位基因的同源重組技術(shù)被使用，但是，這個(gè)方法在當(dāng)年來說，存在效率低、勞動成本高的缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，這就需要科學(xué)家探索更為簡潔高效的基因編輯技術(shù)。 為了實(shí)現(xiàn)利用簡單的方法使特定基因失去功能，科學(xué)家研發(fā)出了RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，希望更易于研究哺乳動物細(xì)胞的基因功能，它具有操作簡單、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。但RNAi不能作用于所有基因和某些細(xì)胞類型(如神經(jīng)元)，而且存在位置效應(yīng)、臨時(shí)性和不完全敲除的缺點(diǎn)[3]。 隨著各種基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，如：鋅指核酸酶技術(shù)(zinc finger nuclease，ZFN)[4]、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)[5]和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR -associated (Cas) 9 system，CRISPR/Cas9)[6]等技術(shù)技術(shù)更迭，基因編輯領(lǐng)域也發(fā)生了革命性的改變。 今天小編就帶大家重新進(jìn)入一下CRISPR/Cas9 技術(shù)和RNA干擾的世界吧，一起來回顧歷史哦~ 圖2.http://www.sohu.com/a/284394775_704327[7] CRISPR/Cas9基因敲除 基因敲除(knockout)是指利用遺傳工程技術(shù)，針對某個(gè)特定已知基因序列，改變生物的遺傳基因，令其功能喪失作用，并進(jìn)一步對生物體造成影響，進(jìn)而推測出該基因的生物學(xué)功能。CRISPR/Cas9 是近年來發(fā)展最快的新基因敲除技術(shù)，它廣泛存在于許多原核生物基因組中，其中的域型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以依賴Cas9內(nèi)切酶家族靶向剪切外源 DNA。轉(zhuǎn)錄后，每個(gè)crRNA (CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)結(jié)合在一起，并和Cas9核酸酶形成一個(gè)復(fù)合物[3]。Cas9核酸酶在crRNA 的指引下，識別保守的間隔相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)并靶向結(jié)合到 DNA 上，從而切割 DNA。這個(gè)技術(shù)操作簡單快捷、成本低廉、脫靶效應(yīng)較低，已經(jīng)成為基因功能研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的武器，極大地加速了藥物靶點(diǎn)的篩選驗(yàn)證及新藥的研發(fā)。
圖3. CRISPR/Cas9技術(shù)工作示意圖[8] RNA干擾 RNA干擾是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解或抑制同源mRNA表達(dá)，從而抑制或關(guān)閉特定基因表達(dá)的現(xiàn)象，其主要是通過短干擾RNA (short interfering RNA，siRNA)和短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9]。dsRNA在Dicer 酶的作用下可產(chǎn)生一系列長度為21~22 nt的siRNAs，后者在細(xì)胞內(nèi) RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，隨后由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。具有核酸酶功能的RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，在結(jié)合部位切割 mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)，封閉內(nèi)源性基因的表達(dá)，使該基因失活，最終達(dá)到基因沉默的作用[3]。
圖4. RNA干擾的示意圖[10] CRISPR/Cas9基因敲除與RNA干擾優(yōu)勢對比 就目前來說，CRISPR/Cas9 技術(shù)的效率已經(jīng)非常高，基本可以在經(jīng)過一次打靶過程就可以得到基因敲除的小鼠，而傳統(tǒng)的基于同源重組的技術(shù)則需要更長的時(shí)間?；贑RISPR/Cas9基因敲除技術(shù)其成本低、制作簡便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因；作為一種新型的靶向基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)已成功在斑馬魚、小鼠和大鼠等多個(gè)物種中得到了廣泛應(yīng)用，此外該項(xiàng)技術(shù)不存在動物物種的限制，其在植物基因修飾中也取得了突破，如大豆、煙草、水稻和小麥中都取得了成功。 CRISPR 技術(shù)的優(yōu)勢是能永久性地改變基因組DNA的序列，但在基因沉默方面RNAi 技術(shù)也有其獨(dú)特的優(yōu)勢。具體來說首先RNAi無需引入額外的蛋白質(zhì)因子，更安全，成本更低；其次RNAi 是一種轉(zhuǎn)錄后水平的可逆的基因沉默技術(shù)，只需通過siRNA的添加與否，或使用小分子化合物調(diào)控siRNA表達(dá)載體上誘導(dǎo)型啟動子的活性就能實(shí)現(xiàn)對靶基因的沉默與開啟；最后RNAi在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，故設(shè)計(jì)siRNA時(shí)只需參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11]。 應(yīng)用 1、CRISPR/Cas9基因敲除 CRISPR/Cas9技術(shù)在藥物研發(fā)的功能基因篩選過程中，只需要將一個(gè)sgRNAs文庫導(dǎo)入細(xì)胞中，再通過相關(guān)表型的評估，即可實(shí)現(xiàn)對基因組的大規(guī)模定點(diǎn)編輯和篩選，進(jìn)而揭示基因的生理功能，為新藥研發(fā)提供可靠的靶標(biāo)。 CRISPR/Cas9技術(shù)不僅僅限于基因敲除，包括大片段的敲進(jìn)，點(diǎn)突變，人源化替換等策略都已經(jīng)在動物模型構(gòu)建中已大展身手，大大縮減了構(gòu)建動物模型的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。而且已廣泛應(yīng)用于各種的基因編輯模型構(gòu)建（主要包括腫瘤和干細(xì)胞系）。此外該技術(shù)應(yīng)用于人體的基因治療也在快速發(fā)展過程中，將為人類疾病的治療帶來巨大的幫助[12]。 2、RNA干擾 ① 基因功能研究 由于RNAi具有很好的特異性和有效的干擾活力，可以使特定基因沉默，使其功能喪失或降低表達(dá)，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具[9]。已有研究表明siRNA能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達(dá)，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似的基因敲除的效應(yīng)。 ② 病毒性疾病的治療 研究表明，人們通過合成一段針對特定病毒基因的siRNA，并將之導(dǎo)入該病毒感染的細(xì)胞，能夠有效地抑制該病毒的復(fù)制，阻斷病毒對細(xì)胞的感染。并且，可貴的是，siRNA在病毒感染的早期就能發(fā)揮抑制作用。因而，siRNA可用來治療病毒性疾病。 ③ 腫瘤病的治療 腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對這一區(qū)段序列的siRNA分子，只注射一種siRNA即可產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的效果，也可以同時(shí)注射多種siRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。 總結(jié) 綜上所述，在基因編輯技術(shù)中，基因敲除技術(shù)與RNAi技術(shù)各有千秋，都被積極地應(yīng)用于一些生物問題的研究，包括一些人類疾病，極大地滿足了研究人員操作不同類型基因組的目的，不僅可以作為基因編輯的工具，也可用于基因表達(dá)調(diào)控。這就好比“寶刀屠龍，號令天下；倚天不出，誰與爭鋒”。 今天的干貨就暫時(shí)到這里啦，各位寶寶們是不是墨水滿滿的呢，咳咳，如果感興趣，一定要隨時(shí)關(guān)注留意小編，定不會錯(cuò)過你想要的，咱們下次再會~小編悄悄地來，又輕輕地走，不要帶走任何遺憾哦 參考資料 [1]https://www.cnblogs.com/pythonicanus/p/10111230.html [2]Smithies O, Gregg R G, Boggs S S, et al. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal β-globin locus by homologous recombination[J]. Nature, 1985, 317(6034): 230-234. [3]李 妤，趙紅業(yè)，崔 勇，魏紅江，李梅章. 基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2017，21(3) [4]Hauschild-Quintern J, Petersen B, Cost G J, et al. Gene knockout and knockin by zinc-finger nucleases: current status and perspectives[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70(16): 2969-2983. [5]Cermak T, Doyle E L, Christian M, et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(12): e82. [6]Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823 [7]http://www.sohu.com/a/284394775_704327 [8]https://www./article/24961 [9]Wilson R C, Doudna J A. Molecular mechanisms of RNA interference[J]. Annual Review of Biophysics, 2013, 42: 217-239 [10]http://blog.sina.com.cn/s/blog_445dac3b0102x8kb.html [11]尚仁福，吳立剛. RNA干擾的機(jī)制及其應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)，2016，28(5) |
|
|
