導(dǎo)  讀

文/朱永官1,2*　陳青林1　蘇建強(qiáng)1　喬敏2（1 城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所  2 城市與區(qū)域生態(tài)學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心）

來源：科學(xué)觀察（2017年第6期）

抗生素的發(fā)明與使用是人類醫(yī)學(xué)史上具有里程碑意義的成就。但是，隨著抗生素的大量生產(chǎn)、使用、甚至濫用，抗生素和抗性基因（耐藥性）污染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的環(huán)境健康問題?？股啬退幮允侵肝⑸锟梢阅褪芸股貙?duì)其的抑制和致死作用進(jìn)而存活和繁殖?？股睾湍退幮缘奈廴臼且粋€(gè)問題的兩個(gè)方面，即抗生素的殘留會(huì)誘導(dǎo)選擇抗性細(xì)菌，促進(jìn)抗性基因的橫向轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致微生物耐藥性的擴(kuò)散，而攜帶抗性基因的微生物擴(kuò)散到新的環(huán)境會(huì)進(jìn)一步繁殖，并有可能通過基因橫向轉(zhuǎn)移將抗性基因傳遞給病原菌，給人類健康帶來災(zāi)難性的危害。目前，除了環(huán)境中背景水平的抗性基因外，主要有人類排放（醫(yī)院和污水處理廠）、動(dòng)物養(yǎng)殖和制藥廠等幾個(gè)來源。

2011年世界衛(wèi)生組織（WHO）在世界衛(wèi)生日的主題是“抗生素耐藥性：今天不采取行動(dòng)，明天將無藥可用”，其數(shù)據(jù)顯示，全球每年約有44萬個(gè)耐藥結(jié)核病(MDR-TB)新發(fā)病例，至少造成15萬人死亡。2015年5月WHO發(fā)布全球報(bào)告，呼吁建立全球抗生素耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)。之后，許多國際組織和機(jī)構(gòu)相應(yīng)提出了行動(dòng)方案，阻擊抗生素耐藥性的蔓延，如二十國集團(tuán)（G20）等。在2016年9月21日聯(lián)合國大會(huì)第71次會(huì)議上，聯(lián)合國各成員國采納了抗生素耐藥性高級(jí)別會(huì)議的政治宣言。這顯示了聯(lián)合國各成員國在預(yù)防后抗生素時(shí)代抗生素耐藥性行動(dòng)上的共識(shí)。為此，聯(lián)合國秘書長宣布成立聯(lián)合國跨機(jī)構(gòu)耐藥性協(xié)調(diào)組（IAGA）。為積極應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥帶來的挑戰(zhàn)，提高抗菌藥物科學(xué)管理水平，遏制細(xì)菌耐藥發(fā)展與蔓延，維護(hù)人民群眾身體健康，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展，2016年國家衛(wèi)生計(jì)生委等14部門聯(lián)合制定了《遏制細(xì)菌耐藥國家行動(dòng)計(jì)劃（2016－2020年）》。世界上許多國家生產(chǎn)的抗生素約一半都作為獸藥和飼料添加劑等。動(dòng)物攝入的抗生素大部分以原藥或代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動(dòng)物糞便和尿液進(jìn)入土壤、水體，從而產(chǎn)生污染，并通過食物鏈對(duì)整個(gè)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生毒害，影響植物、土壤微生物和動(dòng)物的正常生命活動(dòng)和功能。更嚴(yán)重的是，抗生素藥物殘留會(huì)造成病原菌的耐藥性增加，從而危害人類健康，增加人類疾病的治療難度。

絕大部分抗生素原藥及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入土壤后會(huì)迅速與土壤發(fā)生吸附作用，之后的解吸過程會(huì)直接決定其生物有效性。我們研究發(fā)現(xiàn)要解決抗生素的污染問題需要特別關(guān)注抗生素殘留帶來的微生物的耐藥性——抗生素抗性基因。以我國多處大型養(yǎng)殖場周邊土壤作為研究對(duì)象，我們采用分子生物學(xué)手段開展四環(huán)素抗性基因的污染問題研究，發(fā)現(xiàn)抗生素的大量使用導(dǎo)致大型養(yǎng)殖場周邊土壤中微生物抗性基因增加，揭示土壤中抗性基因與四環(huán)素等抗生素的殘留呈顯著正相關(guān)關(guān)系。成果發(fā)表在Environmental Science & Technology上，美國化學(xué)學(xué)會(huì)的化學(xué)和工程新聞專門進(jìn)行了介紹，認(rèn)為是“首次來自中國的關(guān)于農(nóng)用抗生素和土壤抗性基因的研究成果，為政府在抗生素使用及產(chǎn)生后果方面的政策制定提供了建議”。

由于抗性基因的多樣性（數(shù)百個(gè)或更多），傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)（普通的定量PCR）無法了解環(huán)境中抗生素抗性基因的全貌。在2007年，我們有幸為國際著名微生物生態(tài)學(xué)家James Tiedje申請(qǐng)了中科院的愛因斯坦講習(xí)教授計(jì)劃，借此，Tiedje教授于2008年5月初來訪，與我們開展了深入的學(xué)術(shù)交流。通過交流，我們商定采用高通量定量PCR技術(shù)研究環(huán)境抗生素抗性基因。經(jīng)過進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化，我們的高通量定量PCR可同時(shí)檢測244種抗性基因。我們對(duì)國內(nèi)三個(gè)大型養(yǎng)豬場的豬糞、豬糞生產(chǎn)的堆肥以及施堆肥后的土壤樣品進(jìn)行抗性基因分析，共檢測到149種抗性基因。這些抗性基因幾乎涵蓋了目前已知的絕大多數(shù)抗生素類型，即使一些未在豬場使用的抗生素也檢測到了相應(yīng)的抗性基因（圖1)。就抗性基因豐度而言，與不使用抗生素的對(duì)照豬糞樣品相比，共有63個(gè)抗性基因顯著富集，富集倍數(shù)中值為192，單個(gè)抗性基因的最大富集倍數(shù)可達(dá)2.8萬倍。豬糞生產(chǎn)的堆肥中也同樣檢測到了多種類型和抗性機(jī)制的抗性基因，最高的富集倍數(shù)可達(dá)5.7萬倍。研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)抗性基因的豐度與環(huán)境中抗生素和砷銅等重金屬濃度均呈顯著正相關(guān)，說明砷銅等重金屬和抗生素的復(fù)合污染可以增加環(huán)境中抗生素抗性基因的富集。該成果在PNAS上發(fā)表后得到國際同行和公眾的廣泛關(guān)注。Nature專門報(bào)道和詳細(xì)討論了我們的研究成果。其他許多國際媒體如New York Times, New Scientists 均給予了報(bào)道。該論文在Web of Science 中入選高被引論文。

污水和中水回用也是抗性基因傳播的主要途徑。為此，我們同樣采用高通量定量PCR的方法，對(duì)中國7個(gè)代表性城市的公園土壤樣品中的抗性基因進(jìn)行分析，在所有的土壤樣品中共檢測到了147種抗性基因。與未使用再生水澆灌的公園對(duì)照土壤相比，共有105種抗性基因在再生水澆灌的公園土壤樣品中有顯著性富集，其中抗性基因總的富集倍數(shù)最大可達(dá)8655.3倍。同時(shí)在再生水澆灌的公園土壤樣品中檢測到了4種轉(zhuǎn)座酶基因，最高圖1　抗性基因的檢出數(shù)（A）以及不同種類抗性基因所占的比例（B）的富集倍數(shù)可達(dá)2501.3倍。研究發(fā)現(xiàn)抗性基因與轉(zhuǎn)座子酶基因豐度之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，表明轉(zhuǎn)座子可能促進(jìn)了抗性基因的傳播。本研究揭示了再生水澆灌導(dǎo)致了城市公園土壤中抗性基因的富集。

除了污水和中水，污泥作為污水處理系統(tǒng)的副產(chǎn)物，是環(huán)境中抗生素抗性基因的重要存儲(chǔ)庫。而日益發(fā)展的城市使得城市污水處理廠每天產(chǎn)生大量的剩余污泥，截至2015年我國已建污水處理廠已超過3500座，每年產(chǎn)生約3500萬t污泥。堆肥化處理是指在微生物的作用下，將有機(jī)廢棄物轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)的過程，產(chǎn)生的堆肥產(chǎn)品可用作土壤改良劑和肥料。在堆肥化過程中抗生素抗性基因是怎樣變化的，微生物和抗性基因之間又有何關(guān)系？我們采用高通量熒光定量的方法研究了污泥堆肥處理過程中抗生素抗性基因的特征變化，并且采用16S rRNA基因高通量測序法研究了堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)156種抗生素抗性基因和基因移動(dòng)元件，并且在堆肥的過程中，抗生素抗性基因的多樣性和豐度都顯著增加。通過微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)堆肥成熟期放線菌門細(xì)菌顯著增加并占主要地位，由于放線菌是土壤中抗生素的主要生產(chǎn)者，其本身也攜帶多種抗性基因，所以堆肥過程中抗性基因的富集可能是由于放線菌門的變化導(dǎo)致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)與抗性基因結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，證明了堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成變化是影響抗生素抗性基因變化的主要原因，這些結(jié)果發(fā)表在Environmental Science& Technology （Su, et al ., 2015），目前也是Web ofScience 的高被引論文。我們通過污泥長期定位實(shí)驗(yàn)研究了污泥施用對(duì)于農(nóng)田土壤抗性基因的影響，結(jié)果表明直接施用污泥或污泥堆肥有可能在土壤中引入新的抗性基因（Chen, et al ., 2016）。該論文在EnvironmentInternational 發(fā)表后被歐盟Science for Environment Policy引用并做了詳細(xì)報(bào)道。最近我們采用該方法系統(tǒng)研究了我國河口濕地中抗生素抗性基因，揭示了抗性基因的分布與人類活動(dòng)的密切關(guān)系，成果于2017年初發(fā)表于Nature Microbiology 。

我們?cè)趪H合作過程中建立起來的高通量定量PCR技術(shù)在環(huán)境抗生素抗性基因研究中發(fā)揮了重要作用。在此基礎(chǔ)上，我們建立了高通量定量PCR測試研究平臺(tái)，并且發(fā)展了針對(duì)生物地球化學(xué)循環(huán)相關(guān)功能基因、環(huán)境中病原菌和糞源菌的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高通量芯片，為我們開展環(huán)境土壤學(xué)和環(huán)境生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的平臺(tái)。目前我們的平臺(tái)也成為國際合作的平臺(tái)，每年來自美國、英國、澳大利亞、德國和以色列等的科學(xué)家和我們開展深度的合作研究。在抗生素抗性基因研究的基礎(chǔ)上，我們闡述了人類活動(dòng)微生物及其攜帶的基因在環(huán)境中遷移的影響，提出了微生物全球尺度的大規(guī)模遷徙的模式。該論文于2017年9月15日發(fā)表在Science 上。

通過這項(xiàng)研究或這個(gè)科學(xué)故事，我們認(rèn)識(shí)到：一項(xiàng)創(chuàng)新性的研究需要前沿的科學(xué)問題與方法手段的有機(jī)結(jié)合,同時(shí)環(huán)境領(lǐng)域的相關(guān)研究必須面向現(xiàn)實(shí)社會(huì)。