細(xì)胞增殖檢測(cè)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)和大規(guī)模藥物篩選等研究領(lǐng)域。檢測(cè)方法主要分為兩類：一類是直接測(cè)定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力，如Ki67、BrdU以及EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)等；一類是通過(guò)測(cè)定活性細(xì)胞數(shù)目來(lái)間接反映細(xì)胞增殖能力，如MTT、CCK-8等。

在上述檢測(cè)方法中，MTT法風(fēng)靡各大實(shí)驗(yàn)室，一度成為科研老臘肉和小鮮肉的一項(xiàng)必備的實(shí)驗(yàn)技能。雖然MTT法由來(lái)已久且流傳甚廣，但是對(duì)于初次接觸MTT的科研小白來(lái)說(shuō)，要想在短時(shí)間內(nèi)將MTT法練就得“穩(wěn)（重復(fù)性好）、準(zhǔn)（準(zhǔn)確性高）、狠（操作速度快）”也是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)。

任性嬌柔的細(xì)胞以及操作細(xì)節(jié)的忽視很容易就把你拉進(jìn)“大幺蛾子沒(méi)有，小幺蛾子不斷”的悲催循環(huán)中。諸如細(xì)胞鋪板不均勻、鋪好的細(xì)胞狀態(tài)差、復(fù)孔之間的吸光度差異大，以及吸光度值忽高忽低等各類小幺蛾子在MTT實(shí)驗(yàn)中屢見(jiàn)不鮮。

那么科研小鮮肉如何快速?gòu)睦吓D肉手里練就“穩(wěn)、準(zhǔn)、狠”的MTT技能呢？讓小編慢慢告訴你。

1、MTT溶液配制

將MTT粉末用PBS配制成5 mg/mL的溶液，過(guò)濾除菌分裝，避光儲(chǔ)存于-20℃。臨用前取出放置4℃。

2、細(xì)胞接種

將狀態(tài)良好的細(xì)胞以合適的密度接種于96孔板是MTT法的一個(gè)關(guān)鍵步驟。細(xì)胞的接種密度與細(xì)胞的種類以及給藥孵育的時(shí)間密切相關(guān)，過(guò)多或過(guò)少的細(xì)胞密度都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

因此在正式做MTT實(shí)驗(yàn)前不能依賴網(wǎng)上提供的MTT方法，需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定細(xì)胞的接種密度。

1)  收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋成2000、3000、4000、5000、6000和8000 cells/mL的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每個(gè)細(xì)胞濃度接種3孔即可，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

注意：接種細(xì)胞時(shí)先將細(xì)胞懸液吹打均勻，然后倒入加樣槽內(nèi)，用多通道移液器吸取細(xì)胞懸液后將槍頭貼96孔板的孔壁添加細(xì)胞懸液，添加完成后不要晃動(dòng)96孔板，直接放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。如此操作可以大大提高接種的均勻度，而且還可以使細(xì)胞在孔板內(nèi)的均勻分布，不聚集。

2)  在接種后的第48、72和96 h取出96孔板，倒置顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)匯合程度并拍照保存；

小編以96 h的觀察結(jié)果為例（圖1）。從圖1中可以看出，以4000 cells/mL濃度接種的孔內(nèi)細(xì)胞在培養(yǎng)96 h后生長(zhǎng)匯合約80%~90%，而6000~8000 cells/mL濃度的孔內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)滿，而細(xì)胞在長(zhǎng)滿狀態(tài)下會(huì)發(fā)生接觸抑制生長(zhǎng)現(xiàn)象。

因此，后續(xù)若要采用MTT法考察藥物作用于MCF-7細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞的毒性特性（或細(xì)胞增殖抑制），那么在接種MCF-7細(xì)胞時(shí)則宜按4000 cells/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔板。這里選擇觀察96 h是將細(xì)胞接種后貼壁24 h與加藥孵育72 h計(jì)算在了一起。

3)  確定好細(xì)胞接種濃度之后，按照上述方法以4000 cells/mL細(xì)胞濃度接種于96孔板中，并培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。

注意：96孔板的外周孔共36孔不要接種細(xì)胞，用100 μL PBS填充。接種細(xì)胞時(shí)需要定時(shí)搖晃加樣槽，防止加樣槽內(nèi)細(xì)胞懸液沉降，進(jìn)而導(dǎo)致多通道移液器每次移取的細(xì)胞懸液數(shù)量不一致。

3、加藥處理

1)  取出接種細(xì)胞的96孔板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，對(duì)照組加入200 μL完全培養(yǎng)基，加藥組加入180 μL完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔為宜；

2)  將藥物（或藥物的DMSO溶液）用完全培養(yǎng)基稀釋成10倍給藥濃度的系列梯度濃度給藥溶液；

3)  以每孔20 μL的量加入稀釋的系列濃度梯度給藥溶液，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72 h。

4、測(cè)定

1)  孵育結(jié)束后，取出96孔板，吸棄孔內(nèi)藥物溶液，用PBS清洗2次后加入20 μL MTT溶液，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；

2)  孵育結(jié)束后，吸棄孔內(nèi)MTT溶液，加入150 μL DMSO，輕微震蕩10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算出平均值和SD（圖2）。

注意：吸棄MTT溶液時(shí)適當(dāng)傾斜96孔板，然后用多通道移液器貼壁吸取MTT溶液。

5、計(jì)算IC50值

1)  將濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)形式并將給藥組吸光度均值除以對(duì)照組吸光度均值得到細(xì)胞存活率均值（圖3）；

2)  打開Graphpad Prism 7.00，選擇XY圖（圖4）；

3) 將圖3中的數(shù)據(jù)復(fù)制到Graphpad中，點(diǎn)擊Analyze（圖5），選擇Nonliner regression (curve fit) （圖6），點(diǎn)擊OK；

4) 選擇Dose-response-Inhibition項(xiàng)下的“[Inhibitor] vs. normalized response-Variable slope”（圖7），點(diǎn)擊OK；

5) 從圖8中可以得到軟件模擬計(jì)算出的藥物IC50為19.05ng/mL。選擇圖8中Graphs項(xiàng)下的Data 1可以得到數(shù)據(jù)圖（圖9），經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的調(diào)整就可以得到最終的數(shù)據(jù)圖（圖10）；

6、MTT法的更新版

雖然MTT法在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，但由于 MTT 法形成的甲臜不溶于水，需要先吸棄MTT溶液然后加入DMSO溶解之后才能測(cè)定，這不僅使測(cè)定的工作量增加，而且在吸棄MTT溶液時(shí)不可避免地會(huì)帶走甲臜，因此也會(huì)降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

因此檢測(cè)試劑公司急科研小白之所急，瞄準(zhǔn)商機(jī)開發(fā)了CCK-8試劑盒。與MTT法相比，CCK-8所產(chǎn)生的產(chǎn)物溶于水，因此在加入CCK-8孵育后立即可以進(jìn)行吸光度檢測(cè)，既提高了實(shí)驗(yàn)效率又增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

盡管有了MTT的更新版，但是前期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括細(xì)胞密度的確定以及藥物濃度范圍的篩選依然是該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。