現(xiàn)有的細胞增殖和細胞毒性檢測相關(guān)的實驗方法種類繁多，準確性、經(jīng)濟性、可操作性不一，而且部分實驗受限于實驗室條件無法開展。選對適合的實驗方法，不僅可以少走彎路、事半功倍、節(jié)省有限的經(jīng)費和實驗資源，而且有助于建立穩(wěn)定精準的技術(shù)平臺和進一步推進相關(guān)的研究。因此，本文對常見細胞增殖及細胞毒性檢測的方法進行了匯總及比較。

1.CCK?8法

將處于對數(shù)生長期的細胞以1×10⁴個/孔接種于96孔板中，每個檢測時間點設(shè)置5個復孔，每孔100μL培養(yǎng)體系。96孔板四周加入PBS以防止板中的細胞培養(yǎng)液蒸發(fā)。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時間后，每孔分別加入10μL CCK-8試劑，以100μL細胞懸液+10μL CCK-8體系進行孵育。預(yù)實驗確定最佳孵育時間，隨后在培養(yǎng)箱中孵育一段時間后使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值，OD（450 nm）_實驗組-OD（450 nm）_空白對照的值間接反映活細胞的數(shù)量。空白對照指僅有培養(yǎng)液而未加細胞的孔。

2.EdU標記法

用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×10⁶個/mL進行EdU標記，預(yù)實驗確定加入EdU的濃度為50μmol/L，培養(yǎng)箱孵育2 h。經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min和0.5% Triton X-100通透5 min處理后，每 1×10⁶個細胞加入500μL現(xiàn)配的Click-iT反應(yīng)混合物避光染色30 min后加入DAPI室溫避光15 min進行核染色。使用流式細胞儀或者熒光顯微鏡檢測與分析 EdU陽性的細胞占比。

3.CFSE標記法

將細胞用PBS洗滌1遍并重懸。2×10⁶個/mL的細胞懸液加入1μL 5 mmol/L的 CFSE儲存液，配制5μmol/L的工作液。37 ℃避光孵育10 min后，加入4℃預(yù)冷的5倍體積含血清的細胞培養(yǎng)液終止染色，5 min后離心，并用PBS洗2遍后，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于CFSE 標記后的不同時間點用流式細胞儀檢測細胞的平均熒光強度，擴增后與擴增前的平均熒光強度比值反映細胞的擴增倍數(shù)。

4.3種細胞增殖檢測方法的比較

1.Calcein-AM/CellTracker Deep Red活細胞染料雙標流式法

用培養(yǎng)基將細胞調(diào)整為1×10⁶個/mL，分別加入Calcein-AM 至終濃度2μmol/L、CellTracker Deep Red Dye至終濃度0.1 μmol/L，37℃避光孵育30 min后，PBS清洗2遍后用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為2×10⁵個/mL，加入96孔U型底板，每孔加入100μL；向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的毒性物質(zhì)（藥物、化學試劑等待檢測物質(zhì)），并定容至200μL。將培養(yǎng)板置于1 000 r/min離心1 min，放入37℃培養(yǎng)箱靜置4 h進行殺傷后，吹勻細胞，用流式細胞儀上樣，注意進樣相同體積數(shù)的分組樣品。雙陽性細胞群為剩余活的細胞。設(shè)置陽性對照：標記過的細胞不加材料。細胞毒性（%）=（空白對照讀數(shù)-實驗組讀數(shù)）/空白對照讀數(shù)×100%。

2.熒光素酶法

將細胞的密度調(diào)整為1×10⁵個/mL。然后鋪96孔板，每孔加細胞懸液100μL，向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的毒性物質(zhì)（藥物、化學試劑等待檢測物質(zhì)），空白對照不加材料，并定容至200μL。放置培養(yǎng)箱4 h后。按照每孔50μL用量，將2 mg/mL ATP溶液與300 ng/mL熒光素鈉溶液按照1∶3配制發(fā)光底物混合液。取出孵育過后的96孔板，每孔加入50μL 2% Triton X-100，吹打混勻室溫靜置5 min，再次吹打混勻后每孔吸出50μL 轉(zhuǎn)移到黑色96孔酶標板，并加入50μL發(fā)光底物混合液，吹打混勻后5 min內(nèi)用活體成像儀或多功能讀板機檢測熒光值。細胞毒性（%）=（空白組熒光值-實驗組熒光值）/空白組熒光值×100%。

3.LDH釋放法

將細胞的密度調(diào)整為1×10⁵個/mL，取100μL加入96孔培養(yǎng)板中，向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的毒性物質(zhì)（藥物、化學試劑等待檢測物質(zhì)），定容至200μL；細胞自然釋放孔加細胞和培養(yǎng)液各100μL，細胞最大釋放孔加細胞和2.5% TritonX-100各100μL，放入培養(yǎng)箱中4 h。然后將96孔培養(yǎng)板以250 g離心5 min，每孔吸取上清100μL置于平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)5 min，每孔加入30μL HCl（1 mol/L），在酶標儀490 nm處測定吸光度值。按下式計算細胞毒活性。細胞毒性（%）=［反應(yīng)孔OD（490 nm）-自然釋放孔OD（490 nm）/最大釋放孔OD（490 nm）-自然釋放孔OD（490 nm）］× 100%。

4.CKK-8檢測法

制備細胞懸液，計數(shù)。在96孔板中接種細胞懸液，每孔約100μL，同樣的樣本可做3個重復。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時間（37℃, 5%CO2），細胞貼壁需要大約2-4h，如果是懸浮細胞，該步驟可以省去。向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的毒性物質(zhì)（藥物、化學試劑等待檢測物質(zhì)）。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育一段時間，例如6、12、24、48h，具體時間要看待測物質(zhì)的性質(zhì)和細胞的敏感性。向每孔中加入10μL CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比較少，可能會因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕晃動培養(yǎng)板以幫助混勻，或者直接配置含10% CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。另外注意，加樣的過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡，以免影響OD值讀數(shù)。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h。因為細胞種類不同，形成的formazan的量也不一樣，所以如果顯色不夠的話，可以延長培養(yǎng)時間，特別是血液細胞形成的formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6h）。用酶標儀測定450nm處的吸光度（OD）。

細胞活力（%）=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100

A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值

A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值

A（空白）：沒有細胞的孔的OD值

5.MTT檢測法

（1）0.5%的胰酶消化對數(shù)期細胞，加少量血清終止反應(yīng)，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，制成細胞懸液，細胞計數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10×10⁴個/ml，藥物毒性實驗一般每孔細胞數(shù)量5000—10000個（具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實驗判斷）。

（2）將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入90μL細胞懸液, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。

注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻，如每加5個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。

（3）5%CO2，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物。

（4）按照藥物作用時間點，每24 h取出一塊96孔板檢測：

a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；

b) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（用移液器吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內(nèi)側(cè)壁吸取，不要觸碰底部的紫色結(jié)晶?；蛘邔?6孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液）；

c) 每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解后，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內(nèi)孵育10～20 min，這樣有助于 DMSO對紫色結(jié)晶物的溶解）；

d) 加DMSO后10min內(nèi)，用酶標儀檢測各孔波長490nm的吸光值；

（5）MTT結(jié)果分析

6.細胞毒性檢測方法的比較

主要參考文獻：

1.徐大來, 司遠, 田蕾, 等. 免疫效應(yīng)細胞增殖與細胞毒性功能檢測 3 種方法的比較[J]. 南京醫(yī)科大學學報 (自然科學版), 2021 (3): 355-360.

2.Terrén I, Mikelez I, Odriozola I, et al. Implication of interleukin-12/15/18 and ruxolitinib in the phenotype, proliferation, and polyfunctionality of human cytokine-preactivated natural killer cells. Frontiers in immunology, 2018, 9: 737.

3.Terrén I, Orrantia A, Vitalle J, et al. CFSE dilution to study human T and NK cell proliferation in vitro.Methods in Enzymology. Academic Press, 2020, 631: 239-255.