于子惠 吉林大學(xué)衛(wèi)生學(xué)院2011屆

于建成 煙臺于建成中醫(yī)診所

摘要：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體（mammalian target of rapamycincomplex，mTORC）在細(xì)胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與存活、細(xì)胞遷移、血管生成和新陳代謝等重要生理活動。根據(jù)組成蛋白的不同分為mTORC1和mTORC2，其中mTORC2的組成蛋白主要有Rictor，mSin1，mSLT8和Protor等。mTORC2可調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞骨架重組與細(xì)胞遷移及蛋白質(zhì)合成等過程，并作用于Akt、PKC、SGK等形成信號通路。并且隨著研究的深入，在腫瘤中可觀察到異常的mTOR信號通路，同時(shí)發(fā)現(xiàn)mTORC2在多種腫瘤中存在異常的活化。因此，對mTORC2的具體分子機(jī)制的研究，可能為相關(guān)的靶向抑制藥物的研究乃至腫瘤治療提供新思路。本綜述將介紹mTORC2的基本結(jié)構(gòu)、主要功能、參與的信號通路，以及腫瘤治療中的靶向藥物的研究進(jìn)展。

1. mTORC2 概述

1.1.mmTORC2 的基本結(jié)構(gòu)

1991年在酵母中發(fā)現(xiàn)了可作為雷帕霉素（rapamyicn）靶蛋白的TOR基因，它屬于PI3K相關(guān)蛋白激酶家族^［1］。作為一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,因受FRB結(jié)構(gòu)域的影響，TOR基因能實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及磷酸化底物的Ser/Thr等功能。FKBP-rapamycin復(fù)合物位于FRB結(jié)構(gòu)域中，當(dāng)雷帕霉素與其細(xì)胞內(nèi)受體FK506結(jié)合蛋白12結(jié)合時(shí)，可以起到連接的作用。其有兩種mTOR復(fù)合物，根據(jù)組成蛋白的不同分為mTORC1和mTORC2。mTOPC1的組成蛋白主要有Raptor，mSLT8，PRAS40和Deptor等，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期進(jìn)程；而mTORC2的組成蛋白主要有Rictor，mSin1，mSLT8和Protor等，負(fù)責(zé)維持肌動蛋白細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞存活。mTORC2在實(shí)現(xiàn)這些功能時(shí)受生長因子、營養(yǎng)素、能量、應(yīng)激狀態(tài)等影響^［2］。

mTORC2的各組成蛋白調(diào)控著不同的生命過程。在真核生物中保守性較弱的Rictor作為mTORC2的基礎(chǔ)組成蛋白，也能與底物結(jié)合。雷帕霉素能夠致使mTORC1功能下降的原因是解除了mTOR與Raptor的結(jié)合。因?yàn)槔着撩顾夭挥绊憁TOR-Rictor復(fù)合物的形成，一般情況下雷帕霉素并不能影響mTORC2的活性。值得關(guān)注的是，Rictor和Raptor的含量在哺乳動物細(xì)胞中呈反比關(guān)系^［3］，其意義還有待闡明。實(shí)驗(yàn)表明，Rictor可能與Cullin-1和Rbx1等E3泛素連接酶家族的功能有關(guān)，因?yàn)镽ictorThr1135位點(diǎn)的磷酸化可以阻斷它與Cullin-1的相互作用，使得Rictor/Cullin復(fù)合物無法將SGK1泛素化^［4］。mLST8的功能是維持Rictor與mTOR的相互作用，還能與Rictor共同參與調(diào)節(jié)Akt和PKCα疏水基的磷酸化。Deptor是mTOR相關(guān)蛋白，其表達(dá)受到mTORC1和mTORC2的負(fù)調(diào)控^［5］。

1.2.mTORC2的基本功能

1.2.1.mTORC2調(diào)控胚胎發(fā)育

mTORC2是調(diào)節(jié)胚胎和胚外組織發(fā)育的重要復(fù)合物。mTORC2在胚胎發(fā)生過程中，受到生長因子刺激可磷酸化Akt Ser473。Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子，它調(diào)控著基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與存活、細(xì)胞遷移、血管生成和新陳代謝等重要生理活動。實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠胚胎內(nèi)，小鼠受精卵接受shRNA處理后Rictor的表達(dá)受到了抑制，卵裂率極低，Akt活性也顯著降低。同樣方法處理單細(xì)胞期胚胎，受精卵在G2期時(shí)分裂受到了抑制，正常的有絲分裂無法進(jìn)行，并且無法由單細(xì)胞期進(jìn)入二細(xì)胞期。若將動物中的Rictor或Sin1完全敲除，呈現(xiàn)出相似的胚胎致死的表型^［6,7］。

1. 1.2.2. mTORC2調(diào)控細(xì)胞骨架重組與細(xì)胞遷移

TORC2介導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架的組裝是受Rom2、Ypk2等調(diào)節(jié)因子的影響，Rom2是Rho1和Rho2的鳥嘌呤核苷酸交換因子，而Ypk2則屬于AGC 激酶。TORC2參與肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組的調(diào)節(jié)機(jī)制是通過激活RholGTPase開關(guān)，PKG被活化的Rho1激活，繼而MAPK通路被激活。實(shí)驗(yàn)證明，提高Rictor的表達(dá)量可提高PKCα的活性^［8］。目前研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜中

PIP3的合成可通過Rac1活化而激動，并進(jìn)一步促進(jìn)了肌動蛋白細(xì)胞骨架重組^［9］，但mTOPC2調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組裝具體過程有待進(jìn)一步探索。此外，能與mTOR復(fù)合物結(jié)合的Rho-GEF P-Rex1，依賴mTORC2在受到亮氨酸刺激后促進(jìn)細(xì)胞遷移。

癌癥的轉(zhuǎn)移與mTORC2調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架重組與細(xì)胞o遷移這一過程也有相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，Rictor與PKC對乳腺癌細(xì)胞的趨化性和轉(zhuǎn)移起到了共同調(diào)節(jié)的作用^［10］。并且RhoGTP激酶可以調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的運(yùn)動與轉(zhuǎn)移，在這類癌細(xì)胞中，Rictor等mTORC2組成蛋白的表達(dá)量都較高。

1. 1.2.3. mTORC2調(diào)控蛋白質(zhì)合成

已知mTORC1參與蛋白質(zhì)翻譯過程是利用eIF4E、eEF2K、eIF4B等多種蛋白，促進(jìn)翻譯的起始和延伸。最近，越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，mTOPC2通過調(diào)節(jié)新生的多肽鏈的殘基磷酸化，參與蛋白質(zhì)的合成^［11］。TORC2蛋白主要結(jié)合在酵母菌和哺乳動物的細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的膜結(jié)構(gòu)上，因此推斷mTORC2可能在核糖體的膜結(jié)構(gòu)上發(fā)揮作用。PI3K信號系統(tǒng)在受到胰島素的刺激時(shí)，可促進(jìn)mTORC2與核糖體結(jié)合^［12］，而mTORC2與核糖體結(jié)合可以調(diào)節(jié)新生多肽鏈的磷酸化。但目前對于mTORC2調(diào)控翻譯過程的準(zhǔn)確作用底物還不清楚，對于mTORC1和mTORC2如何協(xié)調(diào)促使翻譯過程有序進(jìn)行也不明確，這些均需要進(jìn)行更深入的研究。

1.2.4.mTORC2參與調(diào)節(jié)Akt信號通路

在哺乳動物的生命活動存在了一個(gè)重要的信號通路PI3K/Akt/mTOR，該通路參與細(xì)胞的增殖、生長與存活的調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧和能量缺乏的環(huán)境時(shí)，該通路可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。PI3K/Akt/mTOR通路激活狀態(tài)能夠在腫瘤、糖尿病等疾病中被觀察到，在約50%的急性髓性白血?。ˋML）也能被觀察到^［13］。TM和HM位點(diǎn)同時(shí)磷酸化才可活化Akt，其中TM位點(diǎn)磷酸化激酶為磷酸肌醇激酶1(PDK1)，而HM位點(diǎn)磷酸化激酶為3’磷酸肌醇依賴激酶2(PDK2)。研究發(fā)現(xiàn)，mTORC2能特異性磷酸化Ser473的原因是其具有HM激酶活性，并證實(shí)mTORC2就是PDK2激酶，它對AktSer473 的磷酸化有著至關(guān)重要的作用。在Akt信號通路中mTORC2抑制底物Fox01/3而使細(xì)胞存活。在缺乏mTORC2的細(xì)胞中，Akt HM位點(diǎn)未磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞未能進(jìn)行FoxO1/3磷酸化，而其他底物如GSK3、TSC2不受Akt的影響^［7］。這些研究結(jié)果表明，mTORC2介導(dǎo)的HM磷酸化可能特異性作用于Akt。

1.2.5.mTORC2調(diào)節(jié)PKC

根據(jù)氨基末端的不同，PKC（protein kinase C）被分成了多種亞型，它與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞骨架與細(xì)胞遷移等多種生命活動相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，mTORC2影響了PKC的成熟與穩(wěn)定，同時(shí)它還能夠?qū)⑺衏PKC和部分nPKC的TM位點(diǎn)（PKCα/βII的Thr-638/641）和HM位點(diǎn)（Ser657/660）磷酸化^［14］。當(dāng)細(xì)胞中的mTORC2受到抑制時(shí)，TM位點(diǎn)不能發(fā)生磷酸化，cPKC激酶活性較低。然而，mTOPC2介導(dǎo)TM位點(diǎn)磷酸化的具體機(jī)制尚不明確。而當(dāng)細(xì)胞中的mTORC2受到抑制時(shí)，HM位點(diǎn)的磷酸化有所減弱，使得cPKC活性降低但并不完全消失，若在此基礎(chǔ)上抑制Hsp90，cPKC活性則會進(jìn)一步降低。這表明，mTORC2在相關(guān)分子的協(xié)助下可以促進(jìn)PKC的成熟和穩(wěn)定。

1.2.6.mTORC2調(diào)節(jié)SGK

生長因子可以誘導(dǎo)調(diào)控糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)激酶（SGK），而SGK對滲透壓起著正調(diào)節(jié)的作用^［15］。PDK1在胰島素的刺激下，可以使SGK1 Thr256位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，mTORC2則使Ser422（HM）位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。SGK1在敲除mTORC2的細(xì)胞中發(fā)生失活，進(jìn)而異常磷酸化Fox01/3。同時(shí)，SGK1的其他特異性底物如NDRG1的磷酸化也減少。研究表明，mTOPC2磷酸化HM位點(diǎn)時(shí)受到Protor協(xié)同作用^［16］。目前尚不明確SGK1TM位點(diǎn)的磷酸化機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

1.3.mTORC2相關(guān)結(jié)合蛋白

1.3.1.mTORC2與mTORC1

S6K1-IRS1反饋弧在mTORC2過度激活時(shí)形成，mTORC1磷酸化S6K1，被活化的S6K1抑制IRS1（胰島素受體底物1），而IRS1是一種可以募集胰島素受體關(guān)鍵下游底物的轉(zhuǎn)接蛋白。因此，機(jī)體喪失對胰島素的敏感性，從而導(dǎo)致因依賴胰島素等生長因子的mTORC2磷酸化Akt HM位點(diǎn)的過程受到抑制。

1.3.2.mTORC2與mLST8

mLST8起到激活并穩(wěn)定mTOR的功能，而這一功能是通過mLST8特異性作用于mTOR分子中激酶催化域來實(shí)現(xiàn)的。在缺少營養(yǎng)素等上游因子時(shí), mTOR和Raptor被mTORC2緊密地鎖在一起，使得mTOR與下游的靶基因結(jié)合的功能喪失；反之，mTORC2發(fā)生空間構(gòu)象改變，斷裂mLST8和Raptor之間的結(jié)合，暴露出mTOR,從而與下游靶基因結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，利用RNAi技術(shù)在細(xì)胞中敲除mLST8抑制mTORC1底物磷酸化，底物磷酸化的水平并未發(fā)生改變，說明mTORC1在發(fā)揮作用時(shí)并不是必需mLST8的。

1.3.3.mTORC2與Deptor

當(dāng)與mTOR的c端的DEP結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，Deptor可以負(fù)性調(diào)節(jié)mTORC1和mTORC2的活性。當(dāng)Deptor缺失時(shí)，mTORC1和mTORC2的活性被激活，磷酸化S6K和Akt等，促進(jìn)細(xì)胞的成長和生存；當(dāng)Deptor過度表達(dá)時(shí)，S6K活性受到抑制，Akt因負(fù)反饋環(huán)路的存在而過度激活。Deptor高表達(dá)發(fā)生在28％的多發(fā)性骨髓瘤中，進(jìn)而在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中來維持PI3k及Akt的活性，而當(dāng)Deptor水平降低時(shí)細(xì)胞將死亡。最新研究表明，作為內(nèi)源性抑制劑，Deptor在mTORC1和mTOEC2的作用機(jī)制及生物學(xué)作用中發(fā)揮重要的橋梁作用。

2.特異性抑制劑及抗癌藥物的發(fā)展

2.1.mTOR抑制劑的研究進(jìn)展

目前，共存在3種小分子抑制劑，然而特異性抑制mTORC2的抑制劑尚不存在。這三種抑制劑為雷帕霉素及其類似物、ATP競爭抑制劑及同時(shí)抑制PI3K和mTORC1／2的雙重抑制劑。三種抑制劑因其作用機(jī)制的不同，治療效果也不盡相同，對于疾病的療效也有差異。因此發(fā)現(xiàn)mTORC2的特異性抑制劑成為目前臨床腫瘤抑制劑研究的重心。

2.1.1.雷帕霉素及其類似物

因水溶性和化學(xué)穩(wěn)定性相對較低，雷帕霉素的生物活性受到了極大地限制。后來隨著幾種雷帕霉素類似物的研發(fā)，腫瘤治療上不僅提高了藥物代謝特性還降低了免疫抑制效應(yīng)，而這些類似物主要有替西莫司（temsirolimus，CCI-779）、依維莫司（everolimus，RAD001）、42－雷帕霉素(deforolimus，AP23573) ^［17］。但是不少研究仍表明單一的雷帕霉素抑制劑對于實(shí)性腫瘤作用微弱^［18］。

2.1.2.ATP競爭抑制劑

ATP競爭抑制劑以ATP結(jié)合點(diǎn)為靶點(diǎn)，同時(shí)抑制mTORC1和mTOPC2的活性。作為此類選擇性mTORC1／2抑制劑，PP22能完全阻斷Akt-Ser473位點(diǎn)的磷酸化。近期有研究發(fā)現(xiàn)，特效抗癌藥PP242在治療骨髓瘤時(shí)比雷帕霉素抗癌效果佳的原因是他對mTORC2有良好的抑制力^［19］。然而受反饋效應(yīng)對PI3K的影響，此類抑制劑的治療效果也會大大折扣。

2.1.3.PI3K和mTORC1／2雙重抑制劑

根據(jù)JakeShortt及其團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，抑制PI3K／mTOR信號通路治療淋巴瘤具有顯著的效果^［20］,因PI3K／Akt信號通路活躍度上調(diào)，雷帕霉素及其類似物的治療效果受到限制?？梢酝茢嗟氖窃诹馨土鲋委熤须p重抑制劑因其阻礙了反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)，從而Akt的活性下降^［21］。作為PI3K超家族抑制劑，BEZ235能抑制PI3K的所有亞型、mTORC1及mTORC2^［22］。然而和預(yù)期結(jié)果相反，BEZ235仍能在一定程度上增加PI3K／Akt的活躍度。對此，研究者們提出多種猜測，有人認(rèn)為在微量凋亡濃度的細(xì)胞里，BEZ235對PI3K的抑制強(qiáng)度不足以和因mTORC1受抑制引起的反饋效應(yīng)相競爭。也有人認(rèn)為是BEZ235對mTORC1的抑制效力要比對PI3K的抑制效力強(qiáng)。還有人認(rèn)為，在反饋效應(yīng)里增加Akt活性與PI3K活躍度上升是相互獨(dú)立的，沒有任何聯(lián)系的^［23］。所以，PI3K／mTOR雙重抑制劑并非都能完全抑制mTOR和PI3K的活性，聯(lián)合用藥效果更佳完善。Spender及其實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)通過實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合使用PI3K／mTOR雙重抑制劑或mTOR活躍靶點(diǎn)抑制劑與ABT-737對ABT-737的耐藥問題有很好的解決療效。他們甚至提出了一種對伯基特（氏）淋巴瘤新型有效的治療途徑，聯(lián)合使用mTORC1／2抑制劑與BH3擬晶態(tài)。

2.2.二甲雙胍

近年來研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍（metformin）可以負(fù)性調(diào)節(jié)mTORC1，在臨床上二甲雙胍常用來治療二型糖尿病。而對二甲雙胍這一功能的發(fā)現(xiàn)，使得不少研究者都對采取化學(xué)藥物預(yù)防癌癥抱有了希望。根據(jù)流行病學(xué)的調(diào)查，二型糖尿病患者若服用了二甲雙胍來降低血糖可以降低多種腫瘤的發(fā)生率、復(fù)發(fā)率及致死率，其中尤以胰腺導(dǎo)管腺癌最為突出^［24］。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，服用二甲雙胍的二型糖尿病患者的胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生率比未服用二甲雙胍的對照組降低了62%^［25］。也許這與在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中，二甲雙胍能刺激AMPK有關(guān)，因?yàn)锳MPK不僅可以阻滯mTORC1，還能介導(dǎo)IRS-1在Ser794位點(diǎn)的磷酸化，從而降低PI3K／Akt的活性^［26］．Soares等研究聲稱，Akt和ERK活性受二甲雙胍的調(diào)控機(jī)制完全不同于以往的mTORDE抑制劑，盡管他們都是抑制mTORC1／S6K信號通路為主要機(jī)制。并且二甲雙胍在抑制mTORC1的同時(shí)不會過度磷酸化Akt-Ser473。

2.3.蘆薈大黃素

近年來有研究者對蘆薈大黃素［1.8-二羥基-3-羥甲基蒽醌（1.8-Dihydroxy-3-[hydroxymethyl]-anthraquinon）1,8-Dihydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone；1,8-Dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-9,10-anthracenedione；3-(Hydroxymethyl)chrysazin.］的抗腫瘤作用頗感興趣，主要的抗腫瘤活性集中在對神經(jīng)外胚葉腫瘤、肝癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、皮膚Merkel細(xì)胞癌、胃癌、白血病等腫瘤，抗癌范圍廣泛，蘆薈大黃素對P388白血病細(xì)胞有抑制作用，延長生存期。其作用機(jī)制之一是抑制癌細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的生物合成。具體報(bào)道有蘆薈大黃素通過靶向mTORC2抑制前列腺癌、蘆薈大黃素可誘導(dǎo)鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生自噬性死亡。

3.問題與展望

3.1.PI3K／Akt／mTOR信號通路無論是在正常細(xì)胞生理中還是腫瘤細(xì)胞的形成、增殖及轉(zhuǎn)移過程，都發(fā)揮著重要的作用。重要的分子機(jī)制也隨著研究的進(jìn)展而日漸清晰，但是目前仍存在著不少矛盾和爭議。如mTORC2上下游分子的調(diào)控機(jī)制尚不明確，TSC1／2是否能與mTORC2直接結(jié)合，其影響與在反饋調(diào)節(jié)中增強(qiáng)PI3K的活性從而激發(fā)mTORC2的活躍度相矛盾^［27］。而筆者認(rèn)為通過系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，也許是解開諸多矛盾和爭議的有效手段。

3.2.mTORC2特異性抑制劑的開發(fā)在進(jìn)一步研究mTORC2與mTORC1相互影響機(jī)制的基礎(chǔ)上，可以為臨床腫瘤治療提供有效的幫助。自從發(fā)現(xiàn)mTORC1受到雷帕霉素抑制后，基于PI3K／mTOR信號通路的新型抑制劑就相繼被研發(fā)出來。對于PI3K／Akt信號通路，抑或是mTORC1／2為靶點(diǎn)的抑制劑，研究者均抱有了濃厚的興趣。然而，現(xiàn)階段每一種抑制劑都有著不同程度的副作用和耐藥性^［28］。作為廣泛抑制劑的BEZ235也不能完全地抑制每一個(gè)靶點(diǎn)，與抑制PI3K相比，它對mTORC1的抑制效果更為顯著，仍可激活PI3K/Akt信號系統(tǒng)。因此，在根據(jù)臨床患者實(shí)際病情及腫瘤特性的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用廣泛抑制劑與特異性抑制劑可能會取得更好的治療效果。而中醫(yī)補(bǔ)氣壯陽藥物研究，可以改變cAMP/cGMP、PKA/PKC做為mTORC1／mTORC2下游分子的狀態(tài)，也許為尋找mTOＲC1/mTOＲC2為靶點(diǎn)的抑制劑提供思路。合理聯(lián)合用藥治療一般的腫瘤，采取系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)和系統(tǒng)生物工程研究方法也許是最佳的選擇。

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