 1 PCR引物設(shè)計(jì)課堂筆記 ○ PCR這個(gè)名詞大家都不陌生，但實(shí)際操作時(shí)我們常說的引物設(shè)計(jì)到底是怎么回事呢？今天我就來給大家用實(shí)例演示一下哈。首先，我們要知道引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。 引物設(shè)計(jì)是PCR的關(guān)鍵，附上PCR的基本流程圖：   ○ 引物設(shè)計(jì)的原則： 1.引物長(zhǎng)度：一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度。 2.引物的特異性：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。 3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度。退火溫度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8) 4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物的3′端：引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾；引物3’端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高； 引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗 6.引物的5′端：引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。 下面以實(shí)例操作演示一下加酶切位點(diǎn)時(shí)如何自己設(shè)計(jì)引物： 2 用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記蛋白NR1  ○ 簡(jiǎn)單點(diǎn)說，就是現(xiàn)在我們要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并沒有BamHⅠ這個(gè)酶切位點(diǎn)，也就說我們要在引物設(shè)計(jì)中人為地把BamHⅠ這個(gè)酶切位點(diǎn)的序列添加給GFP基因片段，這樣PCR后得到的GFP基因片段就可以通過BamHⅠ這個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)入到Plasmid 1中，然后綠色熒光蛋白(GFP)就可以來標(biāo)記蛋白NR1，達(dá)到我們之后實(shí)驗(yàn)中來觀察蛋白NR1的目的，示意圖見下。  ○ 已知NR1的編碼序列(~4000bp)
紅色為信號(hào)肽，藍(lán)色為BamHI酶切位點(diǎn), 下劃線標(biāo)出BamHI酶切位點(diǎn)的閱讀框  ○ 此次引物設(shè)計(jì)的要求：PCR擴(kuò)增GFP；GFP兩邊添加BamHI酶切位點(diǎn)；保證NR1的閱讀框不改變。 ○ 第一步：擴(kuò)增GFP基本序列  ○ 當(dāng)終止密碼子TAA位于整個(gè)閱讀框的中間位置時(shí)，我們需要把其去掉，否則就不能表達(dá)全長(zhǎng)融合蛋白了。 ○ 第二步：添加酶切位點(diǎn)，BamHI的識(shí)別位點(diǎn)（ggatcc）  ○ 引物1與引物2是反向互補(bǔ)的噢~ ○ 第三步：保護(hù)閱讀框（很重要）  ○ 注意：紫色標(biāo)注的就是一個(gè)閱讀框，為了保證整個(gè)閱讀框的完整性，此時(shí)我們發(fā)現(xiàn)引物1…g gat cc? ATG GTG…后少了一個(gè)堿基，因此我們需要在引物1…g gat cc? ATG GTG…問號(hào)處添加1個(gè)堿基ｇ（補(bǔ)上的堿基可以任意選，但是盡量補(bǔ)成編碼中性氨基酸的密碼子），與此同時(shí)需要在引物2…gg atc c?? CTT GTA CAG…問號(hào)處需添加2個(gè)堿基ｇｇ（要求同上）。若我們?cè)谝?中已經(jīng)補(bǔ)上2個(gè)堿基的話，那么在引物2中就只需補(bǔ)上1個(gè)堿基就好了。簡(jiǎn)單的記，就是引物1,2中補(bǔ)上的堿基數(shù)前后相加為3（即一個(gè)密碼子的數(shù)量），這樣就不會(huì)影響到后面閱讀框的改變。 ○ 第四步：添加保護(hù)序列  ○ 保護(hù)序列通常為4~8個(gè)，在不形成回文序列的情況下可以任意添加，多為c,g。 ○ 第五步：最后再根據(jù)G/C，Tm值調(diào)整引物的整體長(zhǎng)度。 這就是我們自己動(dòng)手設(shè)計(jì)引物的全過程。當(dāng)然最后引物設(shè)計(jì)是否成功還需要實(shí)際操作后驗(yàn)證一下的。 3 快來練練手吧 ○ 假設(shè)plasmid B全長(zhǎng)序列中不含有EcoRI位點(diǎn)，并已有實(shí)驗(yàn)室利用多克隆位點(diǎn)的NotI和HindIII位點(diǎn)在plasmid B插入了基因X的編碼序列構(gòu)建了plasmid B－X，已知基因X編碼序列中僅含有1個(gè)EcoRI位點(diǎn)。現(xiàn)要求你采用PCR技術(shù)擴(kuò)增plasmid A中的增強(qiáng)型綠熒光蛋白（EGFP）序列，并利用EcoRI位點(diǎn)以同一閱讀框?qū)⑵洳迦氲絧lasmid B－X的基因X中，并保證全長(zhǎng)融合蛋白的表達(dá)。 a. EGFP序列如下： CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCTGCAGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG GATCCACCGG TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGA……………………………………………………………… GCTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC TCTAGATCAT AATCAGCCAT ACCACATTTG TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC CACACCTCCC CCTGAACCTG AAACATAAAA b. 基因X含EcoRI位點(diǎn)的部分序列及其對(duì)應(yīng)的編碼氨基酸殘基如下（GAATTC為EcoRI位點(diǎn)）： 5’…..GCC AGT GGA ATT CTG ATT GCC….. 3’ ...Ala Ser Gly Ile Leu Ile Ala … 請(qǐng)根據(jù)上述信息設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增EGFP的引物 上游引物5’： 下游引物5’： 參考答案： 上游引物5’： GCGGgaattcggATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 下游引物5’： GCGCgaattcgCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 參考資料：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件，丁香園論壇 |
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