高變異藥物生物等效性試驗及量化評價

何春遠^1，2，孫華²，謝海棠²

1.皖南醫(yī)學院，蕪湖 241002，安徽；

2.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院臨床藥學部，蕪湖241000，安徽

國家自然科學基金面上項目（81173134）；安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學科研重點項目（2010A013）

何春遠，男，碩士研究生，研究方向：定理藥理學。

Tel：18255367542   E-mail：1006912735@qq.com

謝海棠，通信作者，女，博士，研究員/教授，研究方向：藥代動力學。

Tel：0553-5738200   E-mail：xiehaitang@sina.com

【摘要】   高變異藥物的生物等效性試驗評價是比較復雜且引人關注的現實課題，具體的高變異藥物生物等效性方法國內目前尚無專門的指導原則，本文參考FDA和EMA的相關指導原則和國內外相關文獻，對高變異藥物生物等效性問題的復雜性、國際上關于高變異藥物采納的法規(guī)、高變異藥物生物等效性試驗樣本含量三個問題進行探討，列出了3種方法來解決參比制劑校正的、半重復或全重復、交叉試驗設計進行平均生物等效性試驗樣本含量問題。為國內申請人在進行高變異藥物生物等效性研究提供參考。

【關鍵詞】   高變異藥物; 生物等效性; 參比制劑校正；樣本含量

1.高變異藥物生物等效性問題的復雜性

1.1高變異藥物的定義

　　高變異藥物(highly variable drug)是指有一個或多個生物等效性評價指標的個體內變異性(within-subject coefficient of variation，CV)≥30%的藥物制劑^[4]。FDA統(tǒng)計的2003年到2005年之間212項生物等效性試驗中有33項高變異性藥物^[5]。如果采用常規(guī)例數的受試者評價會造成把握度太小，II類錯誤的可能性大，容易把等效制劑判為不等效。不采用大量受試者很難去評價高變異藥物的生物等效性，但入組較多的受試者首先會帶來倫理學的問題，健康受試者無法從試驗中受益，其次增加了試驗成本和試驗運行管理的難度(因試驗條件的限制不能同時入組全部受試者，臨床操作可行性降低)^[3]。

　　圖1顯示了兩種藥物的生物等效性結果，藥物A是正常變異，藥物B的個體內變異較大，圖中 X軸上80%~125%代表著生物等效限，這兩個生物等效性研究中，參比與受試制劑藥動學參數（C_max、AUC）的幾何均數比（GMR）均接近于1，對于藥物A， GMR的90%置信區(qū)間在生物等效限范圍內，等效性成立。而藥品B，其GMR的 90%的置信區(qū)間不符合生物等效限，等效性不成立。雖然藥物B的 GMR接近于1，說明試驗制劑可能是一個基于良好設計，在體內與參比制劑行為一致的產品，但必須增加受試者例數才能使藥品B符合生物等效限。

圖1^[6]    正常與高變異藥物生物等效性試驗（GMR均接近1）的圖示

1.2 造成高變異的相關因素

　　大部分高變異藥物為生物藥劑學分類中的2類或4類，這類藥物具有溶解度低、首過效應大、生物利用度低、酸不穩(wěn)定性高、親脂性高等特性。除了藥物本身的因素，制劑因素和飲食時間也可影響藥物的變異性，這些藥物的血藥濃度非常的低，在這種情況下，準確地描述藥代動力學參數難度較大^[7-9]。常見的高變異藥物包括抗抑郁藥阿弋美拉汀、激素類藥物黃體酮、鈣通道阻滯劑維拉帕米等。

　　高變異仿制藥物的申請可能會因一次失敗的生物等效性試驗不予批準，需要重復多次體內生物等效性試驗直至達到要求^[10]。這不僅僅會帶來倫理問題，而且會增加藥物研發(fā)的成本，最終將會加重病人的用藥成本。如果采用常規(guī)例數的受試者評價會造成把握度太小，II類錯誤的可能性大，采用常規(guī)的雙交叉試驗設計和80%~125%的生物等效限，兩周期均服用參比制劑，都有可能得到不等效性結論，這種情況已經在氯丙嗪和維拉帕米的生物等效性試驗中被證實^[11-12]。由此可見，普通的法規(guī)已不適用于高變異藥物生物等效性試驗。

2.國際上關于高變異藥物采納的法規(guī)

　　關于高變異藥物生物等效性方法的探討在國內國際會議中討論了很多年。2004年，FDA考慮是否對于高變異藥物采納一種固定的方法進行評價。同年4月，FDA仿制藥部門（FDA’s office of generic drugs ,OGD)成立了關于高變異藥物生物等效最優(yōu)方案研究的臨床藥學咨詢委員會。隨后收集了關于高變異藥物解決方法的各種提議，包括采用重復交叉設計、多劑量穩(wěn)態(tài)評價、成組序貫研究等。最后經過篩選考慮采納用重復參比制劑法計算個體藥代動力學參數變異性，等效限80%~125%擴大到70%~143%^[13-15]。FDA的仿制藥物部門隨后做了仿真研究^[16]來驗證方案是否可行，并成立了一個工作小組去研究參比制劑校正的平均生物等效性方法?；诜抡嫜芯康慕Y果，在2006年4月工作小組提出了參比制劑校正的平均生物等效性試驗方案。FDA的仿制藥部門經多方面考慮最終決定對高變異藥物采用參比制劑校正的平均生物等效性試驗方案^[17]。并于2010年發(fā)布了第1個屬于高變異藥品(黃體酮膠囊)的生物等效性試驗指導原則(草案)^[18]。在FDA提出方案之后，EMA于2010年也出臺了相應的高變異藥物生物等效性試驗的法規(guī) ^[19]。均利用參比制劑的個體內變異對參數生物等效限作比例化調整，均要求對參比制劑是重復設計。下面我們具體介紹兩個權威指南中生物等效限界值調整的公式以及相應樣本含量的估算方法。

2.1  FDA對于高變異藥物生物等效性試驗采納的方法

　　參比制劑校正的平均生物等效性(reference-scaled average bioequivalence，RSABE)對于AUC和Cmax等效性評估如下式1：  

 ..........(1)

　　μ_T為受試制劑藥動學參數對數轉化后的群體均值，μ_R為參比制劑藥動學參數對數轉化后的群體均值，σ_WR代表參比制劑的個體標準差，θ_S=（ln1.25)2 /σ²WO，并且σ_WO是管理機構（regulatory agency）預先設定的常數。在這個模型中μ_T-μ_R的等效限如式2：

 ..........(2)

FDA將σ_WO的值設為0.25^[18]。 FDA隨后對此方案提出了2點補充說明^[6]：

（1）當σ_WR大于或等于0.294（即CV≥30%)時采用比例均化生物等效性。

（2）點估計的范圍在0.8~1.25，即要求C_max和AUC的GMR在0.8~1.25范圍內。使用點估計范圍會提高醫(yī)生和患者對仿制藥品的信任。

2.2 EMA

　　當參比制劑的個體變異大于或等于預先設定的值(CV_WR為30%，即個體內標準差S_WR=0.294）時，可以用以下公式（3）比例化^[19]。

..........(3)

　　σ_WO是預先設定的標準差，由監(jiān)管機構設置。S_WR代表參比制劑的個體內標準差，與FDA提出的公式σ_WR是相同參數。-0.223和+0.223即為ln0.8和ln1.25，這意味著可根據S_WR值的大小來相應擴大生物等效限。在公式4 中將0.223/σ_WO是定義為常數k。：

 ..........(4)

　　個體內變異系數和參比制劑個體內標準差的換算公式見公式5：

..........(5)

　　 EMA設定σ_WO = 0.294，根據公式4可計算常數k為0.760。EMA規(guī)定的擴大的生物等效限公式如式6：

.......(6)

2.3  EMA和FDA的對比

圖2^[17]   FDA和EMA生物等效限隨個體內變異系數變化對比

　　相同點：對比FDA和EMEA兩個權威指南，都是根據參比制劑的個體內變異性對生物等效限范圍進行調整；均要求對參比制劑是重復設計，部分重復三周期三序列設計（TRR、 RTR、 RRT）、完全重復四周期兩序列設計（TRTR、RTRT）都是可接受的；兩指南均要求參數的GMR仍必須落在傳統(tǒng)的等效限范圍內（80.00%~125.00%）。

　　區(qū)別：（1）2010年EMA規(guī)定的指南更傾向于3周期試驗^[17]，認為4周期唯一的優(yōu)點是能夠計算試驗組的變異性，但是試驗組的變異性在提出的方法中不被用到。這種對3周期重復設計的傾向性在FDA指南中沒有被提及。

    （2）比較公式（2）和（3），差別僅在于對σ_WO設定的不同，FDA是根據數理仿真模擬，將常數σ_WO設為0.25，而EMA將σ_WO設為0.294。

    （3）FDA規(guī)定可將RSABE等效置信區(qū)間的調整應用于參數AUC和C_max。而EMA只將RSABE等效置信區(qū)間的調整應用于C_max。

    （4）FDA規(guī)定由變異系數從30%開始使用這個方法，且σ_WO設為0.25，故變化曲線是不連續(xù)的。這與EMA提出的RSABE方法不同，EMA設定的σ_WO值為0.294（當變異系數為30%，計算的σ_WR值為0.294），變化曲線是連續(xù)的。

    （5）EMA采用RSABE等效置信區(qū)間的調整最寬只到69.84%~143.19%，當CV超出50%，CV升高，但置信區(qū)間不再放寬，而FDA中沒有這一限制。圖3中可以看出FDA規(guī)定的生物等效限范圍要比EMA規(guī)定范圍要寬。

2.4  國際指南對于高變異藥物的相似和不同點

　　各國在法規(guī)中用各種各樣的方法減少高變異藥物生物等效性試驗中受試者例數的選擇。日本、新加坡、東盟世界衛(wèi)生組織的相應指南中建議采用穩(wěn)態(tài)的生物等效性試驗減少變異性，日本法規(guī)同時提出可對高變異藥物采用穩(wěn)定同位素的方法，但這或許需要大量的受試者例數。EMA和美國FDA指南推薦使用參比制劑校正的平均生物等效性試驗，用RSABE這種方法，參比制劑必須服用2次來確定個體內變異性，等效限的范圍隨著參比制劑的個體內變異而定。另外，EMA法規(guī)只在C_max中采用RSABE，而美國法規(guī)對于AUC和C_max都采用RSABE。澳大利亞采用EMA的方法。加拿大法規(guī)沒有刻意區(qū)分高變異藥物^[20]。

表1    各國法規(guī)對高變異藥物BE研究的要求

3.高變異藥物生物等效性試驗樣本含量問題

3.1  FDA和EMA關于樣本量估算

　　隨著個體變異性的增加，在交叉設計中的受試者例數也要相對增加。假設其他因素保持不變，因此，生物等效性試驗樣本含量估算取決于檢驗水準、檢驗效能、藥代參數指標（AUC、C_max 等）的個體變異和試驗藥和參比藥待評價藥代參數指標的差值及設定的等效限值。如下式7：

 ..........(7)

ne：兩周期交叉試驗所需要的樣本例數

n：預試驗的樣本量

CV：變異系數

v：生物等效限（以對數值表示）

δ：試驗制劑與參比制劑的差異（以幾何均數比的對數值表示）

α：檢驗水準，又稱顯著性水平，通常取5%，是犯第I類錯誤的概率。

β：β是犯第Ⅱ類錯誤的概率，也就是把實際有效誤判為無效的概率。1-β表示檢驗效能；即把握度的大小，一般不小于80%。

　　可根據ne結果來估計參比制劑重復設計的BE研究樣本量，其中部分重復的三周期設計樣本量一般為ne的四分之三，而完全重復的四周期試驗設計樣本量一般為ne的二分之一。

計算步驟如下：

（1）計算參比制劑個體標準差SWR，可用以下公式8計算：

 ..........(8)

（2）根據前面公式2或公式6計算生物等效限；

（3） 根據公式9和10分別計算EMA和FDA的以對數值表示的生物等效限；

     v=0.76*S_WR..........(9)

     v=0.893*S_WR..........(10)

（4）δ分別用公式11計算；

    δ=|ln(GMR)|..........(11)

（5）代入二周期交叉實驗公式7即可得ne；

（6）據具體試驗設計類型估計樣本量。

　　參考Phani^[21]文獻中給出的表格，本文給出了80%檢驗效能四周期試驗試驗樣本含量估算的表格，按EMA和FDA指南要求80%檢驗效能四周期交叉試驗樣本含量估算表分別見表2和表3，三周期樣本量可根據公式自行推算。文獻21中還提供了90%檢驗效能三周期或四周期重復試驗樣本含量估算表格，讀者可根據需要自行參考。

表2  FDA關于四周期試驗樣本含量估算

表3  EMA關于四周期試驗樣本含量估算

3.2  FDA和EMA樣本估算的區(qū)別與聯系

　　從上述表格可以發(fā)現FDA相較于EMA需要受試者例數更少。FDA更有利于申辦方的需求，圖3是FDA和EMA在變異系數大于等于30%時的樣本含量需要。圖3也顯示了在變異度小于30%的樣本含量估算，在變異系數小于30%，樣本含量隨著變異系數增加而增加，變異度超過30%采用比例化平均生物等效性方法，當GMR=1.0時，樣本含量變化很小。當GMR偏離1.0，例如1.1時，樣本含量隨著變異系數增加而減少。

　　在EMA中當CV=30%時，不管采用平均生物等效性方法還是參比制劑校正的平均生物等效性方法樣本含量是不變的。相反，在FDA中當CV=30%的時候，樣本含量是變化的，平均生物等效性方法需要的受試者例數是大于比例化平均生物等效性方法的。FDA提出的法規(guī)可能對于高變異藥物存在更大的消費者風險。

　　由FDA和EMA提出的樣本含量估算的特征進一步可發(fā)現，兩樣本含量的差異隨著變異度的增加而減少。是因為在FDA中幾何均值比限度影響等效限范圍比EMA的大。當變異度大于50%時，EMA中隨著變異度的增加樣本含量增加的速度是高于FDA的，因為EMA中變異度大于50%時，生物等效限是不變的，而FDA沒有這樣一個限制。

圖3^[22]  FDA和EMA樣本含量隨個體內變異系數變化的比較圖

3.3樣本估算舉例

　　高變異藥物生物等效性試驗樣本含量估算問題同樣是一個復雜且迫切的現實問題，本文參考Phani^[21]提出的樣本含量估算方法，給出了公式法、查表法及軟件法三種方法解決高變異藥物進行生物等效性試驗需要的樣本例數問題。以下提出一個假設并且給出了樣本估算方法實例。

　　【實例】  假如在進行一個試驗藥物的BE預試驗中，預試驗的樣本數是12例，得到參數C_max的個體內變異系數CV為0.32，預試驗得到的C_max的幾何均數比為0.95，那么如果進行一個四交叉（α為0.05、β為0.20）的BE正式研究，至少需要多少樣本量。

根據公式計算步驟如下：

根據FDA的法規(guī)要求：

已知：CV=0.32   

由公式8可得到SWR=0.312

由公式2可得到BE等效界值可放寬至[0.757 ,1.32]

由公式10、11可得到V=0.892*0.312=0.278

δ =|ln(0.95)|= 0.0513

t(α,2n-2),t(β,2n-2)值分別為1.71、0.858

用公式即得到ne=25.973≈26

由于是四周期交叉試驗  故n≈13

同理根據EMA的法規(guī)要求：

用公式即得到ne=39.245

由于是四周期交叉試驗  故n≈20

所需樣本含量為20。

查表2和表3可知：

當CV=32%時

查FDA關于四周期試驗試驗樣本含量估算表格可知：n=13  與計算結果一致

查EMA關于四周期試驗試驗樣本含量估算表格可知：n=20  與計算結果一致

　　我們也可通過一些統(tǒng)計學軟件來對樣本量進行計。PASS， nQuery，S + 和 SAS 等軟件都可計算生物等效性試驗的樣本量。下面以PASS為例，介紹通過軟件計算的步驟。我們仍是通過兩周期雙交叉試驗設計的樣本量來估算估計參比制劑重復設計的BE研究樣本量。

　　運行PASS軟件，選擇“means” → “two means”→“2×2Cross-Over designs” → “Equivalence Tests using Ratios”出現如圖4所示窗口，然后在“find（solve for）”選擇“N”，即計算樣本含量；選擇power=0.8、α=0.05；RU（等效標準上限）選擇1.321（根據公式2算出），RL（等效標準下限）選擇0.757（根據公式2算出）；R1（True Ratio）為0.95；COV（Coefficient of Variation，變異系數）填入0.32。選擇或填好以上數字后，單擊“run”運行。運行結果如圖5所示，按FDA等效限計算2周期樣本含量估計結果為27例，四周期即為13例。

　　如上法按EMA等效限范圍RU（等效標準上限）選擇1.268（根據公式2算出），RL（等效標準下限）選擇0.789（根據公式2算出）如圖6計算2周期樣本含量為38例，四周期為19例。與公式法和查表的結果基本一致。

圖4 根據FDA規(guī)定的等效限計算的樣本含量結果

圖5  根據EMA規(guī)定的等效限計算的樣本含量結果

　　以上三種計算的結果有少許的差異是因為軟件樣本量估算時沒有考慮預試驗的例數。藥學工作者在以后進行高變異藥物樣本含量估算時可以參考以上任何一種方法對樣本量進行估算。需要注意的地方是，本文介紹的樣本量估算是基于統(tǒng)計學考慮所需納入的最低樣本量，在實際方案設計中還應考慮到試驗中受試者脫落的可能性，以及藥監(jiān)部門法規(guī)所設定的最低樣本要求，一般需要篩選適當多一些的受試者入組試驗。

　　綜上所述，高變異藥物的生物等效性試驗評價是一個比較復雜的問題，同時也是一個引人關注的現實課題。FDA和EMA所提出的RSABE法是根據參比制劑個體變異對等效限進行比例化調整，可避免納入過多受試者參加試驗，降低試驗成本，提高臨床試驗的可操作性。但關于具體的高變異藥物生物等效性方法國內目前尚無專門的指導原則, 藥監(jiān)部門未出臺相應評價細則，還需大量試驗基礎與理論的結合，需要更加深入細致的研究和探討。因此注冊申請人和臨床研究單位在進行生物等效性試驗前需要充分掌握受試制劑和參比制劑詳細的藥物代謝情況及其個體內的變異情況， 判別研究的藥物有沒有高變異的屬性。 如果是高變異藥物，還需了解藥物的安全范圍，如果認為C_max差異較大對于臨床的影響不大，基于臨床的充分理由，則可以放寬C_max等效接受范圍，鑒于EMA的方法更加嚴格，國內申請人在進行高變異仿制藥BE研究中應盡量采用EMA的標準，并選擇合適的樣本含量進行研究。

　　迫切希望國家有關部門早日出臺更加科學規(guī)范的指南對高變異藥物進行生物等效性試驗進指導，為國內臨床研究單位解決高變異藥物生物等效性研究問題提供可采納的方法, 從而更加科學可靠地評價高變異藥物的生物等效性。

致謝：感謝國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心生物統(tǒng)計學部黃欽博士對本文的審閱指導。

國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心

參考文獻  略