作者：解螺旋.子非魚(yú)

Western blot(蛋白印跡)作為科研研究中最為平常的實(shí)驗(yàn)，卻蘊(yùn)含了很多知識(shí)，可謂是小實(shí)驗(yàn)里卻有大文章。盡管絕大多數(shù)研究僧在接觸該實(shí)驗(yàn)時(shí)都會(huì)被虐的體無(wú)完膚，卻也在和WB斗志斗勇的過(guò)程中積累了不少經(jīng)驗(yàn)。正所謂前人種樹(shù)，后人乘涼，現(xiàn)在小魚(yú)就把各位前輩做WB的各種經(jīng)驗(yàn)總結(jié)起來(lái)，希望對(duì)大家能有所幫助。

WB的基本原理

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)，經(jīng)常用于目的蛋白的表達(dá)特性分析、組織定位、表達(dá)量分析及與其他蛋白的互作。依其原理，可分為兩種方法：A、直接法和B、間接法。

兩種的方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較：

WB的一般流程：

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

1：合適的鹽濃度下，保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。

2：盡量除去核酸，多糖，脂類(lèi)等干擾分子

3：提取蛋白質(zhì)過(guò)程中，應(yīng)在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入適合的蛋白酶抑制劑）。

4：蛋白樣品建議分裝后冷凍干燥或直接以液體態(tài)置-80℃中保存，不要反復(fù)凍融。

5：蛋白濃度低時(shí)，可使用超濾膜濃縮或者用真空凍干機(jī)將蛋白凍干。

凝膠濃度與蛋白分離范圍

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

1：上樣時(shí)：根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整蛋白上樣量，盡量保證每孔上樣量保持一致。

2：膠最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如果需要保存，最好用濕潤(rùn)的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。

3：為了檢測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要設(shè)置內(nèi)參（一般指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白）。

4：為了確保western blot結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性，設(shè)置合適正確的對(duì)照是必不可少，一般需要設(shè)置的對(duì)照如下——

陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的工作效率；

陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性；

二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性；

內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果。

用于western blot的雜交膜主要有兩種：NC膜和PVDF膜，可依據(jù)目的蛋白與膜的結(jié)合能力及膜的孔徑來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。

兩個(gè)膜之間的比較：

轉(zhuǎn)膜方法：分為兩種濕轉(zhuǎn)法和半干法

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

1：膠在負(fù)極，膜靠近正極；濾紙不要大過(guò)膜，防止短路；

2：夾好膜和凝膠后，確定在凝膠、膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。

3：注意一定要戴手套或塑料鑷子接觸膜，避免手上的蛋白和油脂降低轉(zhuǎn)膜效率。

4：轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，尤其是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常 會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

5：對(duì)于濕轉(zhuǎn)法：一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA-400mA之間，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。大片段的>50KD的可以選用350mA,小片段的可以用250mA。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

1：常見(jiàn)的封閉液有5%脫脂奶粉、BSA和Western Blot膜封閉液（生物試劑公司提供）。但是封閉液的選取具體得看抗體說(shuō)明書(shū)，有的抗體是明確要求只能用BSA，而封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況5%BSA會(huì)比5%牛奶的效果好。

2：選擇抗體時(shí)，一方面需要考慮所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一方面需要考慮所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。

WB做完后，有時(shí)需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。然而最備受推崇的定量分析軟件Quantiy One軟件因其高昂的售價(jià)令很多人望而卻步，但除了該軟件外還有一個(gè)比較簡(jiǎn)單的圖像處理軟件ImageJ可以很方便的進(jìn)行灰度和密度分析。

ImageJ的軟件界面

1.ImageJ對(duì)WB條帶進(jìn)行灰度分析

1）File|Open打開(kāi)WB結(jié)果圖片

2）圖片類(lèi)型設(shè)置：Image|Type|8bit

3）去除圖片背景：Process|Subtract  Background

在Subtract Background窗口按照以下條件進(jìn)行設(shè)置：

4）設(shè)置定量參數(shù)：Analyze |SetMeasurements,點(diǎn)擊Area，Mean Gray Value及Integrated Density

5）設(shè)置單位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里輸入“pixels”

6）將圖片轉(zhuǎn)換成亮帶，Edit|Invert

7）選擇Freehand Selection,盡量把條帶圈起來(lái)，點(diǎn)擊鍵盤(pán)m，出來(lái)IntDen灰度值

8）復(fù)制數(shù)據(jù)IntDen進(jìn)行分析

2. Image J 對(duì)WB條帶進(jìn)行密度分析

1）步驟同前，F(xiàn)ile|Open打開(kāi)WB結(jié)果圖片

2）如果條帶不正，需修正

Image transform rotate調(diào)節(jié)angle值，直到條帶水平為止

3）選中矩形選項(xiàng)，圈中第一個(gè)條帶，AnalyzeGels Select Firstlane（快捷鍵Ctrl 1），然后移動(dòng)第一個(gè)條帶上的矩形到第二個(gè)條帶上，Analyze Gels Select Second Lane（快捷鍵Ctrl 2）,最后Analyze GelPlotlanes

選中直線工具，將開(kāi)口的波峰關(guān)閉

選中魔棒工具，點(diǎn)擊波峰可以顯示波峰下面積，即條帶的密度值

以第一個(gè)數(shù)值為基數(shù)，其他數(shù)值與第一個(gè)數(shù)值的比值即為相對(duì)密度。