蛋白質(zhì)印跡法 (免疫印跡試驗(yàn)) 即 Western Blot，其工作原理是經(jīng)過 PAGE (根據(jù)分子大小) 分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體 (例如硝酸纖維素薄膜) 上，然后將目的蛋白與特異性抗體進(jìn)行孵化。由于抗體只與目的蛋白結(jié)合，未結(jié)合的抗體被洗掉，只留下與目的蛋白結(jié)合的抗體。最后通過顯影檢測(cè)結(jié)合的抗體，條帶灰度與蛋白量相對(duì)應(yīng)，因此可以反映蛋白質(zhì)的表達(dá)情況^[1]。

WB 實(shí)驗(yàn)包括制樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體和顯影等多個(gè)步驟（如圖 1），莫慌莫慌，小 M 帶你來一一化解。 

^{圖 1. Western blot 的流程圖[2]}

萬丈高樓第一步：準(zhǔn)備材料 

要想實(shí)驗(yàn)節(jié)奏穩(wěn)，準(zhǔn)備工作那可要妥妥的——緩沖液配制。小 M 在此總結(jié)了 WB 實(shí)驗(yàn)中所涉及的各類緩沖液的配方，拿走拿走別客氣～

滑動(dòng)查看更多頁面

表 1. Western blotting 各類緩沖液配方

默默問一句，看完這些配方，您倦了嗎？瘋狂計(jì)算，反復(fù)稱量，您累了嗎？小 M 且在這里為您獻(xiàn)上 MCE 多種速溶顆粒產(chǎn)品 (可戳往期→讓“速溶顆粒”解放你的雙手)，不用猶豫，省時(shí)省力，您且受累收好唄！

 只要樣品做得好，完美結(jié)果少不了 

配好了溶液，就該輪到把樣品的蛋白分離出來了！那么樣品處理該注意什么呢？

低溫操作！低溫操作！低溫操作！重要的事說三遍。為最大限度保證蛋白原有結(jié)構(gòu)，所有涉及蛋白的操作都需在冰上進(jìn)行！

1. 細(xì)胞裂解液的制備。在冰上用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞。根據(jù)每 10⁷ 個(gè)細(xì)胞加 1 mL 裂解緩沖液的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液。細(xì)胞重懸液在 4 ℃ 下放置 5-10 分鐘，期間劇烈震蕩 3-4 次，每次 30 秒，實(shí)現(xiàn)充分裂解。放入離心機(jī)內(nèi)，12,000 rpm 離心 13-15 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的離心管中，棄去沉淀。

如果是制備組織裂解液的話，解剖目標(biāo)組織一定要迅速，建議多次離心去除雜質(zhì)。

2. 蛋白樣本制備。取少量裂解液，通過 BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取出 50 μg 蛋白對(duì)應(yīng)的溶液至離心管中，加入 1×SDS 上樣緩沖液調(diào)平體積。將樣本緩沖液中的細(xì)胞裂解液在 100 ℃ 下煮沸 5-10 分鐘。

 上樣跑膠需選擇合適凝膠 

緊張又忙碌地制備完蛋白樣品，然后就是上樣和跑膠。(恰恰恰，跑個(gè)膠，先檢查下作業(yè)唄！) 首先是根據(jù)蛋白大小選擇合適的凝膠，參考下表 2。

然后將蛋白樣品上樣至 SDS-PAGE 凝膠孔中，記得在樣品旁邊的孔內(nèi)點(diǎn)上 marker。細(xì)胞裂解液或組織勻漿的總蛋白上樣量一般為 20-30 μg，電泳時(shí)長(zhǎng)一般 1.5 小時(shí)，先用 80 V 跑 30分鐘，使各樣本處于同一水平，待 marker 開始分離后將電壓調(diào)至 120 V 再跑 1小時(shí)。

表 2. 蛋白大小與推薦的凝膠百分比

轉(zhuǎn)膜不要喪氣，成敗在此一舉 

順利到了轉(zhuǎn)膜這一步，已經(jīng)快完成實(shí)驗(yàn)啦~ 轉(zhuǎn)膜分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)兩種，轉(zhuǎn)膜時(shí)間應(yīng)根據(jù)蛋白大小進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

 濕轉(zhuǎn)是指轉(zhuǎn)印過程中凝膠和膜被浸入充滿轉(zhuǎn)印緩沖液的槽中，適用于大多數(shù)各種分子量的常規(guī)蛋白轉(zhuǎn)印。半干轉(zhuǎn)是指凝膠和膜被夾在預(yù)先潤濕緩沖液的濾紙之間，濾紙與平板電極直接接觸。濕轉(zhuǎn)使用更廣泛，成本低；半干轉(zhuǎn)相對(duì)來說更加節(jié)約時(shí)間，通常只需要 10 min 即可，具體時(shí)間視蛋白大小和儀器條件決定。不論是半干轉(zhuǎn)還是濕轉(zhuǎn)，小 M 都有幾個(gè)共通小 tips 要給你：1 提前將 PVDF 膜浸入預(yù)冷的甲醇中 5s 來激活；2 轉(zhuǎn)膜時(shí)要注意趕走膜與膠之間的氣泡；3 轉(zhuǎn)膜材料的放置順序（如圖 2a）

圖 2. 轉(zhuǎn)膜的物料順序：陰極，海綿 (濕轉(zhuǎn)需要)，濾紙，膠，PVDF 膜，濾紙，海綿 (濕轉(zhuǎn)需要)，陽極^[3]

勝利的曙光：敷抗體顯影 

行百里者半于九十，大家在最后一步一定要堅(jiān)持！通常，在孵育一抗前需要用封閉緩沖液在室溫下封閉膜 1 小時(shí)，以使膜表面可有效地附著蛋白質(zhì)或抗體，然后用 PBST 洗滌膜 3 次，每次 5 分鐘，接著將封閉后的膜與稀釋后的一抗在 4 ℃ 下過夜孵育。洗滌后使用稀釋后的偶聯(lián)二抗在封閉緩沖液中室溫孵育 2 小時(shí)，用 PBST 洗滌后加入 ECL 顯色液孵育 1-3 分鐘，利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像。(注意注意：加入 ECL 顯色液后應(yīng)全程避光！否則前功盡棄。)看到這里，相信大家對(duì) western blot 的流程已經(jīng)了然于心了吧，是不是迫不及待地想上手練習(xí)啦 一通操作猛如虎，一看結(jié)果想哭。WB 結(jié)果有問題怎么辦？別怕！小 M 仍有對(duì)策！詳情可戳→我就不信這個(gè)邪！打破 Western Blot玄學(xué)操作。最后，貼心、暖心的小 M給大家奉上一系列相關(guān)產(chǎn)品，助大家一臂之力，快來看下吧

相關(guān)產(chǎn)品

RIPA 裂解液 (強(qiáng))

傳統(tǒng)的細(xì)胞、組織快速裂解液，適用于 Western Blot (WB)、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等實(shí)驗(yàn)。

磷酸酶抑制劑 Cocktail III (EDTA-Free, 10× in ddH₂O)

是一種質(zhì)譜兼容的通用型蛋白和磷酸酶抑制劑 cocktail。

Tris-甘氨酸-SDS 速溶顆粒 (1 L of 1×)

常用作 SDS-PAGE 緩沖液，也可用作 WB 緩沖液。

快速封閉液速溶顆粒 (100 mL of 1×)

常用于 Western Blot 和 ELISA 的抗體封閉步驟，可在 15 分鐘內(nèi)完成封閉。

PBS-T 速溶顆粒 (1 L of 1×)

常用作 ELISA、Western Blot 等免疫分析實(shí)驗(yàn)中的洗滌緩沖液，也可用于抗體稀釋及封閉液的配制。

3-Color Prestained Protein Marker

分子量范圍為 10-190 kDa。

Ultra High Sensitivity ECL Kit

用于檢測(cè)辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù) 

參考文獻(xiàn)

[1] Mahmood T, Yang PC, et al. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012 Sep;4(9):429-34. 

[2] Meftahi, GH, Bahari, Z, Zarei Mahmoudabadi, A, Iman, M, Jangravi, Z , et al. Applications of western blot technique: From bench to bedside. Biochem Mol Biol Educ. 2021; 49: 509– 517. 

[3] Wenying Pan, Wei Chen, and Xingyu Jiang, et al. Analytical Chemistry 2010 82 (10), 3974-3976