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水晶水母，學名為維多利亞多管發(fā)光水母 來源：www.ecoxotic.com 文 | 朱勇（美國南加州生物技術(shù)公司Vivoscript科研副總裁）
每年六、七月份，在美國西北太平洋海岸邊，都會出現(xiàn)成千上萬的水晶水母。它們直徑不超過10厘米，沒有頭，沒有有毒的觸角，全身都是透明的，在海水中搖曳著。當受到驚擾的時候，它們會在傘型身體的下緣發(fā)出一束束綠光。夏天一過它們又全都消失。日出日落，潮漲潮退，年復(fù)一年，周而復(fù)始，好像從遠古到永遠，都不會改變。 直到二十世紀六十年代初的一個夏天，幾個長桿撈網(wǎng)突然劃破海面的平靜，開始一網(wǎng)一網(wǎng)地捕撈水晶水母。 在此后的三十多年里，水晶水母（學名叫維多利亞多管發(fā)光水母）的綠色螢光的奧秘被一點一點發(fā)現(xiàn)。 綠色螢光蛋白（GFP）的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成為生命科學革命性的里程碑， 而以GFP及其它熒光蛋白為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子成像技術(shù)成為生物醫(yī)藥科研的不可缺少的工具， 被譽為二十一世紀的顯微鏡。GFP的光輝照亮了世界的每個角落，徹底改變了人類對疾病的認知過程。 GFP的發(fā)現(xiàn)和普及過程跌宕起伏，涉及四個實驗室和六個關(guān)鍵人物，其中三人因此獲得諾貝爾化學獎。GFP的歷史在以前多有介紹，包括饒毅老師于2008年發(fā)表的博客[1]，其中描述最為翔實的是Marc Zimmer教授今年出版的新書[3]。綠色螢光蛋白的故事仍值得我們一遍又一遍地重溫和回味。 - 下村修的假說 - 那些長桿撈網(wǎng)的主人是在美工作的日裔學者下村修（Osamu Shimomura）和他的實驗室老板Frank Johnson，及實驗室其他成員。 下村修出生于1928年，從小在日本和中國長大。當?shù)诙w原子彈爆炸在長崎時，當時年僅16歲的下村修正在附近的軍工廠工作。他目睹了閃光和巨大的蘑菇狀煙云。他在黑色的雨中跑回家，到家時身上的白襯衣已變成灰色。 下村修在1960年應(yīng)邀并憑借著福布萊特獎學金到美國普林斯頓大學做訪問學者。他先在普林斯頓大學工作22年，后又在伍茲霍爾海洋研究所做科研。他一直對生物發(fā)光感興趣。為什么水晶水母可以發(fā)綠光是他孜孜不倦不舍不棄想要回答的問題。 在將近20年的時間里，每年夏季他和家人從東海岸一路開車到西海岸，在華盛頓大學的“星期五港”實驗室外的棧橋上大批大批地捕撈水晶水母?；氐綄嶒炇遥置χ阉傅膫闵w下緣切下來，不厭其煩地分離和分析各種成分。剪切，擠壓，過濾，攪拌，沉淀…… 幾十次實驗和數(shù)萬只水母之后，下村修終于弄清楚了綠色熒光的奧秘： 水母有兩個發(fā)光蛋白，第一個他命名為水母素（aequorin），是一個熒光素酶，在碰到鈣離子時會發(fā)出藍光[4]。第二個就是綠色熒光蛋白或GFP。水母素發(fā)出的藍光作為能量會傳給GFP，激發(fā)出綠色熒光。但GFP的含量在水母中遠低于水母素，從水母中提取GFP更加耗時耗力。 下村修用來切水母傘體下緣的機器，由他當時的老板Frank Johnson設(shè)計[2]。 水母素的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了兩篇重要的論文發(fā)表[5, 6]。水母素被作為鈣離子的傳感器注射到藤壺的肌肉細胞和烏賊的神經(jīng)細胞里，當肌肉收縮時或是神經(jīng)細胞放電時，科研人員第一次在細胞里清楚地看到了明亮的藍色閃光。 科學界意識到了發(fā)光蛋白的可能應(yīng)用，但每一篇論文雖然只需要幾毫克的水母素，卻需要幾萬只水母來提煉。這種昂貴的技術(shù)注定無法普及。 下村修當時只對水母素蛋白感興趣，而并不在意GFP。他提出了一個假說：GFP蛋白僅靠它自己不能發(fā)熒光，需要水母體內(nèi)的酶加工才會變成熒光蛋白。 如果這個假說成立，GFP在生物科研中用處就不大了， 因為它在其它生物個體中無法獨立發(fā)光。但遺憾的是，該假說當時被普遍接受， 對以后GFP的研發(fā)有著深遠的負面影響。再加上GFP蛋白提取困難，在隨后的20多年里，GFP的科研幾乎沒有任何進展。 - 史上最悲壯論文 - 故事中的第二個人物是比下村修小23歲的Douglas Prasher博士。Prasher在喬治亞大學的MiltonCormier實驗室作博士后時候，和其他成員成功地從水母中找到并克隆了水母素的基因，并用該基因在大腸桿菌了表達了水母素蛋白。 這是一個不小的成就。同從水母中提取蛋白相比，用細菌表達制備蛋白要方便、省時、省力和便宜得多，也人道得多。 任何實驗室想要用水母素作為鈣離子的傳感器，都可以直接用細菌生產(chǎn)或以合理的價格購買。水母素的來源不再是一個瓶頸，直到今天它仍在實驗中被廣泛用來檢測鈣離子。 后來Prasher也在伍茲霍爾海洋研究所建立了自己的實驗室。他開始把目光投向了無人問津的GFP。他產(chǎn)生了一個獨特的想法，如果下村修的假說不成立呢？ 也許GFP本身就能發(fā)熒光，并不需要水母的其它蛋白處理加工。如果這樣，GFP就可以通過基因拼接的方式被附著在任何蛋白的末端。而目標蛋白在活細胞內(nèi)甚至是活的個體內(nèi)的一切生理狀態(tài)下的活動都能被看得清清楚楚，就像時時刻刻有一盞探照燈照著它。 而那時候人們還沒有任何手段追蹤蛋白在活細胞或活體里的動態(tài)變化。驗證這一想法的第一步就是克隆GFP的基因?；蚴堑鞍椎脑闯绦颉Ｓ辛嘶?，后續(xù)工作就容易地多。 Prasher把自己的這些想法和計劃組織起來，作為科研基金的申請交了上去。但Prasher的假說與占主導(dǎo)地位的理論背道而馳，因而他不斷碰壁，申請一次次的被拒絕。但功夫不負有心人，終于Prasher從美國癌癥協(xié)會獲得了20萬美金的科研基金來支持這個項目。 從80年代初起，Prasher也開始一次次地在初夏前往西海岸“星期五港”實驗室，大批大批地撈水晶水母。但Prasher與下村修兩者的差異是，下村修感興趣的是蛋白，而Prasher搜尋的是GFP的基因。 由于在當時的條件下，很多現(xiàn)在普及的分子生物學的手段還沒有被發(fā)明，Prasher的工作量與下村修相比只多不少。 在將近3年的時間里，Prasher先從約7萬只水母中提取足夠的RNA建立水晶水母的基因庫（cDNA library），再用同位素標記的探針雜交的方法來大海撈針。一遍遍地嘗試，一遍遍地失敗，再嘗試，再失敗。直到他拿到了完整的GFP基因。他將GFP基因轉(zhuǎn)到了大腸桿菌里表達，又提取了GFP蛋白。 但殘酷的結(jié)果使他墜入了絕望的深淵：GFP并不能發(fā)綠熒光！看來下村修的理論是對的。他本來就有些動搖的自信心遭到致命一擊。 Prasher是一個孤獨的科學家，他不擅于和同行交流。 他和下村修在一個研究所共事多年，研究的課題緊密相關(guān)，但兩人只有一次談話的場合，還是在遠離研究所的一次會議上。在他苦悶的時候，在他的實驗走到瓶頸的時候，他無人可以傾訴，可以交流。這時候他的20萬科研基金已經(jīng)用完了，再申請又被拒絕。他心灰意冷，徹底放棄了GFP。
但在Prasher徹底告別GFP之前，他還是把克隆GFP基因的過程和結(jié)果寫成一篇論文，于1992年發(fā)表[7]。 在文中，他承認了GFP本身并不發(fā)熒光，下村修的理論是對的。這可能是歷史上最悲壯的一篇論文。在看似無邊的黑暗和疲倦中，Prasher不知道他與綠色的曙光有多么接近。 Prasher的這篇論文引起了兩位同行的注意：哥倫比亞大學的生物學家Martin Chalfie和加州大學圣地亞哥分校的錢永健 （Roger Tsien）教授。兩個教授都發(fā)電子信件向Prasher索要GFP基因。Prasher毫不猶豫地無條件給兩個實驗室寄去了。
Chalfie是研究線蟲的專家。線蟲約一毫米長，經(jīng)常被用作模型來研究動物的發(fā)育過程和初級神經(jīng)系統(tǒng)。它的一大優(yōu)勢就是全身上下是透明的，這是驗證熒光蛋白標記技術(shù)最理想的動物模型。 Chalfie得到GFP的DNA后把它交給在實驗室里工作的研究生Ghia Euskirchen。Euskirchen發(fā)現(xiàn)Prasher的GFP基因并不齊整，在首尾各多了一些堿基，因此它表達的蛋白并不是天然的GFP蛋白，而是抻長版的GFP，前后都有些多余的氨基酸殘基。 原來Prasher在把GFP基因插到表達質(zhì)粒上時，用了當時的通行方法，用兩個限制性內(nèi)切酶切出來含有GFP基因的DNA片段，再接到質(zhì)粒上。限制酶方法方便但不精確。 為了精確地把GFP基因插到表達質(zhì)粒上，Euskirchen使用了剛發(fā)明不久還沒有普及的PCR技術(shù)。對于基因剪拼來說，限制酶方法是用斧頭砍，接縫的地方總是多一塊或少一塊，而PCR方法則是激光刀，可以把一個基因準確地切割下來，一個堿基不多，一個堿基不少。她把GFP基因嚴絲合縫地插入到質(zhì)粒里。 令她大吃一驚的是，表達該質(zhì)粒的細菌在培養(yǎng)的時候就是綠色的，在熒光顯微鏡下觀察竟然發(fā)出明亮的綠熒光。Euskirchen成為世界上第一個在大腸桿菌中看到GFP熒光的人。 至此下村修的理論被證明是錯誤的。GFP不需要其它酶加工。它的三個氨基酸構(gòu)成光核或發(fā)色團，而蛋白的其余部分折疊成一個桶狀，將發(fā)色團圍在中間，就象一個有燈罩的臺燈一樣。而Prasher的GFP蛋白由于首尾多了一些氨基酸，在細菌中不能形成正確的桶狀構(gòu)象，就發(fā)不了熒光。 Chalfie的團隊迅速地用GFP標記了線蟲的對接觸敏感的蛋白，觀察到它在線蟲體內(nèi)神經(jīng)細胞的表達。這一成果1994年發(fā)表在《科學》雜志上[8]。Prasher由于提供了基因，被列為論文的最后作者。那期《科學》的封面就是一張在黑色的背景中發(fā)綠色熒光的線蟲的照片。 文章的發(fā)表引起了世界性的轟動。千千萬萬個學者為這張照片而癡迷。用GFP作為工具監(jiān)測活的生物個體里的基因表達和蛋白變化為解決無數(shù)個生命不解之謎提供了鑰匙。 發(fā)表Chalfie論文的那期《科學》雜志封面。 錢永健差不多同一時間得到Prasher的GFP基因，但卻沒有立刻開展這個項目。 錢永健是錢學森的表侄，在美國出生，16歲就獲得西屋科學獎。他是化學方面的專家，他的實驗室缺乏有生物背景的人。錢在等他剛招的生物博士后Roger Heim來做這個項目。在Heim還沒有加入錢的實驗室之前，錢永健就聽說了Chalfie的實驗室在GFP上取得的突破。他們決定另辟蹊徑，在酵母里表達了GFP。 另外他們以GFP為基礎(chǔ)，產(chǎn)生了一系列的突變蛋白，產(chǎn)生包括藍色，黃色和青色等不同顏色的熒光[9]。這樣在同一實驗中，兩或三個不同的蛋白可同時被跟蹤監(jiān)測。 他們還在GFP蛋白里置換了一系列的氨基酸，大大提高了GFP的穩(wěn)定性和發(fā)光強度。在今天生物醫(yī)學研究中大部分被使用的GFP都是錢的實驗室研制出的加強版GFP。 如果說Chalfie的那篇《科學》論文是向世界宣告一個工具的誕生，那錢的工作就是使這個工具更好用，更方便。洪水之門一下子被打開了，使用熒光蛋白技術(shù)的論文呈幾何級數(shù)增長。今天發(fā)表的生物醫(yī)藥領(lǐng)域科研成果有一半以上都用到這一技術(shù)。 2008年10月，瑞典皇家學院宣布諾貝爾化學獎將被授予對GFP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用有突出貢獻的三位科學家：下村修，Chalfie，和錢永健。而也起了關(guān)鍵作用的Prasher卻遺憾地與諾貝爾獎失之交臂。 更令人感慨的是，Prasher此時已不再從事與科學有關(guān)的工作。當記者找到他時，他正在阿拉巴馬州的一家豐田車車行打工，開班車接送客人，掙著最低工資。 原來在放棄了GFP項目不久，Prasher離開了伍茲霍爾海洋研究所，在阿拉巴馬州找到一份政府科研的工作。但不幸的是，由于政府撤銷了對該科研項目的投資，Prasher失去了這份工作。他又不想離開那個城市，但那里的科研工作機會實在有限。為了養(yǎng)家糊口，Prasher無奈放棄了科學，找到了這份臨時工。 Chalfie和錢在記者采訪時和后來的諾貝爾獎演講時都強調(diào)了Prasher的關(guān)鍵作用。錢永健邀請并資助了Prasher一家去瑞典參加諾貝爾獎頒獎典禮。目前Prasher又重返科研，在錢的實驗室里工作。 通過Google Scholar檢索出的每年發(fā)表的提到GFP的論文數(shù)。 - 無論成敗都是英雄 - GFP的故事令我感慨萬千。對這一段歷史，也許每個人得到的啟示都不一樣，可以探討的話題很多。 IQ和EQ與成功的關(guān)系；細節(jié)決定成敗的含義；每一個突破性成果的背后的研究生，博士后，和實驗員的貢獻；科學權(quán)威的理論對科學發(fā)展的影響；當代科研基金的評獎機制能否孕育出革命性的成果；運氣在科研中的作用（從80年代末起，每年夏天的水晶水母潮竟然神秘地消失了[2]）；對前沿技術(shù)（比如90年代初的PCR）的早期使用所獲得的巨大優(yōu)勢…… 但我今天只想談?wù)剝蓚€話題：科學與技術(shù)，貢獻和榮譽。 一個月前（10月23日）華爾街時報刊登了一篇隨筆，題目為“基礎(chǔ)科學之謎”[10]。作者Matt Ridley是資深的生物學家和暢銷書作者。 他在文中的主要觀點是縱觀人類歷史，技術(shù)的發(fā)展是復(fù)雜的，和科學的進步關(guān)系并不大。往往是新技術(shù)的出現(xiàn)才帶來了科學的突破，而不是像人們普遍認為的那樣，科學的發(fā)展引發(fā)了技術(shù)的革新。 文中指出，是先有了蒸汽機，才建立起熱動力學；先有了X射線晶體技術(shù)，才發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。文章的一個推論是政府耗巨資支持基礎(chǔ)科研是沒有必要的。 我認為Ridley的觀點有些以偏概全。就拿生物醫(yī)藥來說，也許在早期，這種現(xiàn)象確實普遍存在：先發(fā)現(xiàn)了阿斯匹林，幾十年后其機理才逐漸浮出水面。 但在今天，從生物機理（科學）到確定藥靶再到新藥研發(fā)和使用（技術(shù)）是占主導(dǎo)地位的模式，而GFP的歷史更是一個典型的例子。 下村修在一次又一次地提取水母中的發(fā)光蛋白時，他只想去解決生命的奧秘之一。但一旦GFP的機理被弄清楚了，GFP蛋白標記技術(shù)就水到渠成呼之欲出。Chalfie的論文完成了由科學到技術(shù)蛻變的第一步，而錢永健的實驗室和銷售加強版GFP基因的公司則完成了第二步：新興技術(shù)的成熟化和產(chǎn)業(yè)化。 再舉一個例子。PCR技術(shù)雖然是1983年問世的，但真正使其推廣的關(guān)鍵是能夠耐高溫的TaqDNA聚合酶。這種酶是在六、七十年代搞基礎(chǔ)研究的生物學家在探索黃石公園的溫泉中生長的細菌時發(fā)現(xiàn)的[11]。一個技術(shù)的誕生和成熟過程可能來源于幾十年來科學的積累：PCR技術(shù)誕生就是建立在DNA復(fù)制過程理論基礎(chǔ)上，而其推廣則離不開Taq酶的發(fā)現(xiàn)。 GFP的歷史還告訴我們，科學和技術(shù)之間不能簡單地歸納為線性的單向關(guān)系，科學和技術(shù)之間有著非常復(fù)雜的動態(tài)作用過程。由于GFP的發(fā)現(xiàn)（科學），才有了熒光蛋白標記技術(shù)，許多過去無法回答的生物問題才能迎刃而解（科學），包括許多疾病的分子機理，這又進一步促進了新藥的研發(fā)（技術(shù)）。科學產(chǎn)生技術(shù)，技術(shù)推動科學，科學再產(chǎn)生新的技術(shù)，如此循環(huán)反復(fù)。 咱們再來談一下貢獻和榮譽。在今天，任何科研項目的成功都要依靠團隊的合作，而且這個趨勢只會愈演愈烈。據(jù)華爾街時報報道，擁有幾千個作者的論文也已不足為奇[12]。在這種時代的背景下，對任何一個科研成果來分析比較每位參與者的貢獻將會越來越困難。 在GFP的發(fā)現(xiàn)和推廣的過程中，下村修是開拓者，Prasher起到承前啟后的作用，Chalfie證實了自己的遠見，錢永健善于改進，而 Euskirchen和Heim擁有一流的實驗設(shè)計和執(zhí)行能力。 要想從中挑出三個人授予諾貝爾獎是一個很艱難的抉擇。我相信諾貝爾獎評委是想努力做到公平的，他們?yōu)榇苏J真調(diào)查了一年才做出的決定[3]。但由于每單項獎每年授予人數(shù)不能超過三個人，諾貝爾獎的評選結(jié)果注定有其不公平性。諾貝爾獎既是給個人的榮譽，更是對某個科研領(lǐng)域的肯定。 Prasher在GFP技術(shù)的發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用，但功虧一簣，痛失諾貝爾獎。他在大眾的眼里被媒體塑造成悲劇的角色。當我們在為他嘆息的時候，我們有沒有想到我們是可以改變這一結(jié)局的？ 每一個做出貢獻的人都應(yīng)該是我們的偶像，不管有沒有得到諾貝爾獎或其它榮譽。得到諾獎的人值得我們敬仰和歌頌，沒有得到的人更需要鮮花和喝彩。社會、媒介和政府都有責任，讓那些應(yīng)該得諾獎而沒有得到的人享受同樣的榮耀和待遇。 從古至今，人類憑借著自強不息的精神，對知識的好奇心，對真理的渴望，不斷推動科學和技術(shù)的交替進步，促進社會的發(fā)展。在漫漫的科技歷史長河中，既有牛頓和愛因斯坦這樣燦若星辰照亮世界的天才人物，也有Prasher在黑暗中躑躅而行的寂寥身影。他們都是英雄。
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