我做了很久的western blot，尤其是phospho-抗體，可以算是達(dá)人了。我根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)磷酸化蛋白之western blot提出以下建議，供剛?cè)腴T的同仁參考：
1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信。
2.加一抗后最好4度過(guò)夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。因?yàn)榱姿峄牡鞍字徽伎偟牡鞍琢康臉O少部分。4度也可使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時(shí)即可。
3.磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。個(gè)人認(rèn)為，Cell signaling公司做的磷酸化抗體不錯(cuò)，尤其是MAPKs磷酸化抗體。
3.最好根據(jù)廠商的protocol來(lái)操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。如Cell signaling會(huì)建議用含5%BSA的TBST稀釋phospho-p38等抗體，效果不錯(cuò)，而不是用常見的含5%non-fat milk的TBST。
4.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會(huì)有不同要求。
5.研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。如壓完phospho-p38抗體后，我會(huì)把相同的membrane做strip后再壓p38,然后再strip一次，再壓內(nèi)標(biāo)actin。6.做磷酸化蛋白WB時(shí),除了目標(biāo)蛋白的band以外,往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的band.磷酸化抗體不好的話,甚至?xí)撼龇翘禺愋缘腷and,而沒(méi)有你想要的band,所以壓片以后,你一定要根據(jù)markers比對(duì)一下,你壓出的band分子量是否正確.我以前壓WB時(shí),壓出了一條band,就以為是我想要的那條,然后還根據(jù)趨勢(shì)推測(cè)可能的機(jī)制,走了不少怨枉路.還有一次,把markers的分子量記錯(cuò)了,比對(duì)出來(lái)的結(jié)果當(dāng)然也不對(duì).
7.磷酸化蛋白WB時(shí)backgroud也往往較深,所以壓片時(shí)間要適當(dāng),不能太長(zhǎng)或過(guò)短,太長(zhǎng)則backgroud太深蓋住想要的那條band,時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有band或者band太淺.
8.磷酸化蛋白WB時(shí),用TBST洗時(shí)也要注意一下,搖床的轉(zhuǎn)速不要太快,洗的時(shí)間不要太長(zhǎng),孵育一抗和二抗之后分別洗5min 3次即可,寧愿background深一些,總比做不出來(lái)強(qiáng)得多.另外，洗的時(shí)候，最好不要把幾張membrane疊在一起洗。
10.對(duì)我的lysis buffer配方作以下說(shuō)明:
(1)Na3VO4要活化
(2)我的配方配的是100ml 細(xì)胞裂解液,但如您各個(gè)成分的體積加起來(lái),會(huì)發(fā)現(xiàn)total=102.1ml,那是因?yàn)檫@些
11.正如我在第5點(diǎn)所說(shuō)的,"研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量“。這有兩種方法，一是：相同的sample在不同的well中上樣兩次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個(gè)gel，壓內(nèi)標(biāo)。但是本人不建議如此做，因?yàn)檫@樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此，比較公認(rèn)的，本人也建議如此的方法，即：將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去（strip），strip solution如下
100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)
2% SDS (stock 10%, 取20ml)
62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)
加水至100ml
然后50度水浴30min.
許多人會(huì)建議55度水浴30min。Strip solution是用來(lái)去除已結(jié)合的抗體，但也會(huì)去除部分的蛋白，導(dǎo)致蛋白信號(hào)變?nèi)酢Ｎ冶救私?jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水浴時(shí)有時(shí)溫度不穩(wěn)定，溫度定為55度時(shí)往往其溫度容易超過(guò)，導(dǎo)致較多的蛋白也被去除，故建議溫度設(shè)為50度30min，既能有效去 |
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