1、膠和膜放反了：如果在轉(zhuǎn)印的過(guò)程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉(zhuǎn)移到緩沖液中，而不會(huì)到達(dá)膜上。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)印，凝膠應(yīng)靠近三明治的負(fù)極，而膜對(duì)應(yīng)正極。

2、轉(zhuǎn)膜效率低：轉(zhuǎn)膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場(chǎng)強(qiáng)度、轉(zhuǎn)印時(shí)間和緩沖液的PH值。一般來(lái)說(shuō)，蛋白越大，轉(zhuǎn)移的越慢。轉(zhuǎn)移大蛋白最好的方法是用高的電場(chǎng)強(qiáng)度。而小蛋白長(zhǎng)時(shí)間處于高電場(chǎng)強(qiáng)度下可能會(huì)傳出轉(zhuǎn)印膜。

避免這個(gè)問(wèn)題的方法是用0.2μm孔徑的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印。如果蛋白的等電點(diǎn)接近緩沖液的pH值，那么這個(gè)蛋白攜帶的電荷很少，在電場(chǎng)中頁(yè)幾乎不移動(dòng)。如果你的目的蛋白是強(qiáng)堿性的，那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。

在轉(zhuǎn)印之后，你可以通過(guò)染膠或第二塊膜來(lái)判斷轉(zhuǎn)印效率。為了幫助你直接監(jiān)控轉(zhuǎn)印效率，使用預(yù)染Marker，它們?cè)陔娪疽约稗D(zhuǎn)膜之后可直接觀(guān)察到。

試劑放置太久或存放條件不正確：抗體會(huì)慢慢降解，如果反復(fù)凍融的話(huà)，它會(huì)快速降解。底物應(yīng)儲(chǔ)存在-20℃。

3、抗體不純或滴度太低：一抗的濃度差異很大，應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定一抗的稀釋度。過(guò)猶不及，太多的抗體頁(yè)會(huì)阻礙抗原與抗體的結(jié)合。一般的原則是以1：100-1:1000來(lái)稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1：1000-1：10000來(lái)稀釋腹水或超免疫動(dòng)物的血清。Bio-Rad的印跡級(jí)別的二抗稀釋度是1：3000。

4、酶失活了：疊氮鈉是辣根過(guò)氧化物酶的抑制劑。不要再HRP顯色的Western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結(jié)合的抗體中，而無(wú)副作用。另外，只能使用蒸餾的去離子水。

5、使用Tween-20洗滌：Tween-20(吐溫-20)可能會(huì)干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時(shí)它的終濃度只有0.05%-0.1%，但仍可能會(huì)影響結(jié)合。因此除了封閉之后的第一次洗滌，其他洗滌過(guò)程中都不使用Tween-20，不過(guò)，這可能會(huì)使背景升高。

6、檢測(cè)系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度：確保蛋白的上樣量在檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度范圍內(nèi)：

辣根過(guò)氧化物酶 500pg/band

堿性磷酸酶 100pg/band

增強(qiáng)的堿性磷酸酶 5pg/band

膠體金 100pg/band

增強(qiáng)的膠體金 10pg/band Immun-Star

化學(xué)發(fā)光 10pg/band