時間：2014-07-01  來源：學(xué)術(shù)堂

　　胃癌前病變(Precancerouslesionsofgastriccarcinoma,PLGC)是一類易發(fā)生癌變的胃黏膜病理學(xué)變化,在其基礎(chǔ)上發(fā)生的胃黏膜細(xì)胞異型增生是胃癌發(fā)生的重要組織學(xué)基礎(chǔ)。由于胃癌發(fā)生發(fā)展的隱匿性強(qiáng),發(fā)現(xiàn)后及時手術(shù)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移也較為常見,因此防治PLGC已成為胃癌二級預(yù)防的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

　　

　　胃癌嚴(yán)重威脅著人類的生存,其發(fā)病率及死亡率高居全世界所有惡性腫瘤的第二位。干預(yù)胃癌的有效手段之一則是對PLGC進(jìn)行阻斷及逆轉(zhuǎn)。但是西醫(yī)目前尚無成熟安全的藥物或治療措施,相對而言,中醫(yī)藥則具有更加明顯的優(yōu)勢,不僅使患者癥狀得到改善,而且能從病理上部分逆轉(zhuǎn)PLGC。課題組經(jīng)過長期有效的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié),從胃癌前病變“痰氣火三邪蘊(yùn)結(jié)”入手,創(chuàng)立消痰養(yǎng)胃方。本文通過檢測大鼠胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞凋亡相關(guān)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá),探討該方對胃癌前病變的影響機(jī)制,這將為臨床進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究時間2013年3~12月。

　　

　　1 材料與方法

　　

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動物

　　

　　清潔級Wistar雄性大鼠,體重140~160g,中國科學(xué)院上海試驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物許可證號碼:SCXK(滬):2012-0002。

　　

　　1.2 試劑與儀器

　　

　　1.2.1 藥品與試劑

　　

　　消痰養(yǎng)胃方組成柴胡9g、制半夏15g、茯苓15g、黃連9g、白花蛇舌草15g、蒲公英30g、桂枝9g、制大黃6g、白芍15g、炙甘草6g。藥材由上海雷允上中藥飲片廠提供,附檢驗(yàn)報告,并經(jīng)長征醫(yī)院制劑室制成含生藥濃度為6g/ml的水煎膏;N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG):日本東京化成工業(yè)株式會社;無水乙醇,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號20120531);脫氧膽酸鈉,上海日初生物科技有限公司(批號20120815);維酶素片:新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司(批號20120102),研末配成0.1g/ml混懸液;SP染色試劑盒:上海博光生物科技有限公司。

　　

　　1.2.2 主要儀器

　　

　　電熱恒溫水浴箱,型號:HH.W21.Cu600;光學(xué)顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng):OLYMPUS公司產(chǎn)品;石蠟切片包埋機(jī):德國LEICARM2135型;高速低溫離心機(jī):德國Sigma,3-18K。

　　

　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法

　　

　　1.3.1 分組處理

　　

　　75只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組及模型組?？瞻讓φ战M15只,模型組60只。模型組根據(jù)2ml/100g體重要求,起始灌胃量為100μg/ml的MNNG溶液,2日1次,灌胃4周后,再予100μg/mlMNNG溶液自由飲用20周,每只大鼠予1ml無水乙醇灌胃3天1次,進(jìn)食2d后再禁食1d,禁食當(dāng)日下午予20mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液飲用。每周三上午夾尾1次,保持大鼠爭奪激怒狀態(tài),持續(xù)10min,連續(xù)24周。造模過程中死亡4只。造模結(jié)束后,采用隨機(jī)數(shù)字表抽取8只大鼠進(jìn)行病理確認(rèn)。模型組再隨機(jī)分為消痰養(yǎng)胃方組、維酶素組、模型空白組,每組16只。消痰養(yǎng)胃方組及維酶素組分別給予消痰養(yǎng)胃方及維酶素混懸液灌胃,消痰養(yǎng)胃方組將浸膏制為0.1g/ml混懸液灌胃,濃度為10ml/kg,每日1次;維酶素組將維酶素片研磨制成0.1g/ml的混懸液以10ml/kg灌胃,每日1次;用藥時間均為6周。

　　

　　1.3.2 免疫組化法檢測胃黏膜細(xì)胞

　　

　　Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)第30周末將大鼠按0.3ml/100g體重量腹腔注射10%水合氯醛麻醉處死,游離胃部,沿胃大彎切開,取材部位分別為胃大彎、胃小彎、胃竇部、賁門,并制成石蠟切片。脫蠟后予3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5min,PBS沖洗3次,每次5min;2次各5min的微波修復(fù),再分別加入1:80和1:100的抗Bax和Bcl-2抗體,4℃過夜,PBS沖洗3次,每次5min。37℃下分別加入生物素標(biāo)記的二抗及辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,各10min,PBS沖洗3次,每次5min。DAB顯色,脫水透明后封片。

　　

　　采用常規(guī)SP法。每批實(shí)驗(yàn)光強(qiáng)度及放大倍數(shù)固定,同時設(shè)立陰、陽性對照。隨機(jī)選擇10個視野,首先按陽性細(xì)胞所占百分比打分:分別為0分、1分、2分、3分、4分,相應(yīng)所占百分比為<5%、5%~25%、26%~50%、51%~75%、>75%。再按染色強(qiáng)度打分:分別為0分、1分、2分、3分,相應(yīng)染色強(qiáng)度為無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色。最終得分為陽性細(xì)胞百分比打分與染色強(qiáng)度打分相乘結(jié)果,≥3分為陽性,記錄各組分值并計算陽性表達(dá)率,算出積分均數(shù)。

　　

　　1.4 統(tǒng)計處理

　　

　　已死亡大鼠不納入統(tǒng)計。所用統(tǒng)計軟件為SPSS13.0,計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s),計量資料多組間比較采用方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　

　　2 結(jié)果

　　

　　Bax陽性率及積分均數(shù)表達(dá):空白對照組>中藥治療組>陽性藥物組>模型對照組;Bcl-2陽性表達(dá)率及積分均數(shù)表達(dá):模型對照組>陽性藥物組>中藥治療組>空白對照組,中藥治療組與陽性藥物組及模型對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),陽性藥物組與模型對照組相比也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。





　　

　　3 討論

　　

　　“正常胃黏膜-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-異型增生-胃癌”這一病理演變過程中已為學(xué)術(shù)界所共識。文獻(xiàn)研究證實(shí)胃癌前病變的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切,細(xì)胞凋亡紊亂在其發(fā)生發(fā)展中起到了決定性的作用。因此治療胃癌前病變的重要方法則是干預(yù)胃黏膜細(xì)胞凋亡紊亂,恢復(fù)增殖與凋亡的動態(tài)平衡。

　　

　　細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞程序性死亡的一種方式,其重要生理作用則是清除衰老和病變細(xì)胞,維持細(xì)胞的生理穩(wěn)定和數(shù)量的動態(tài)平衡,隨著病情發(fā)展,增殖與凋亡之間的這種穩(wěn)定關(guān)系被打破,出現(xiàn)細(xì)胞惡性增殖,而細(xì)胞正常凋亡受到抑制。

　　

　　Bcl-2和Bax在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起到了重要作用。Bcl-2的升高能延長細(xì)胞存活時間抑制細(xì)胞凋亡;而與Bcl-2具有一定同源性的Bax則能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,二者不僅能維持細(xì)胞生理和數(shù)量上的平衡而且比值能反映細(xì)胞凋亡程度。

　　

　　胃癌前病變可歸于胃脘痛、呃逆、痞滿等范疇。一般認(rèn)為,PLGC的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)相兼。我們結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn),根據(jù)PLGC證候特征,認(rèn)為痰邪是PLGC的病機(jī)核心,并認(rèn)為其演變規(guī)律為:各種致病因素侵入人體,使脾胃運(yùn)化功能失調(diào),津液停聚成痰,痰邪阻滯于胃,導(dǎo)致氣滯,同時痰郁化火,從而致使痰、氣、火交阻損傷胃絡(luò),導(dǎo)致胃黏膜腺體萎縮,腸上皮化生或不典型增生。胃黏膜細(xì)胞在各種致病原因誘導(dǎo)下逐漸惡變,造成細(xì)胞始終存在代謝異常,這種代謝異常產(chǎn)生的物質(zhì)可稱為“痰邪”,并且將會一直存在于細(xì)胞周圍,不斷污染和損害正常細(xì)胞,從而將其“培育”為胃癌細(xì)胞。

　　

　　基于上述認(rèn)識,我們運(yùn)用消痰和胃方(由柴胡、制半夏、茯苓、黃連、白花蛇舌草、蒲公英、桂枝、制大黃、白芍、炙甘草組成),獲得滿意療效。方中柴胡、制半夏合用苦辛溫燥,痰氣并治;茯苓、黃連、白花蛇舌草、蒲公英、白芍,健脾祛濕、清熱解毒;桂枝與制大黃,通絡(luò)導(dǎo)滯;炙甘草補(bǔ)中。

　　

　　本實(shí)驗(yàn)采取以化學(xué)損傷為主的多因素造模,結(jié)果表明消痰養(yǎng)胃方可調(diào)節(jié)胃癌前病變胃黏膜細(xì)胞增殖與凋亡平衡,從而有效干預(yù)胃癌前病變,這一過程可能是通過增強(qiáng)Bax陽性率及積分均數(shù)表達(dá),抑制Bcl-2陽性率及積分均數(shù)表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。