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我國(guó)中草藥資源豐富，中草藥在防治疾病、保健營(yíng)養(yǎng)方面起到不可替代的作用。隨著人們對(duì)健康的關(guān)注，中草藥中農(nóng)藥殘留的研究變得口益重要。中草藥中的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響到中草藥的品質(zhì)和食用安全，與此同時(shí)嚴(yán)重制約了我國(guó)中藥材的出口。因此，不論是為了增加出口創(chuàng)匯，或是滿足用藥安全的需求，探索中藥的農(nóng)殘分析檢測(cè)的新方法，制定詳細(xì)的藥材農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)，具有重大的意義。 中藥材在種植防蟲害、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、土壤中殘存、采收加工及儲(chǔ)藏等情況下均有可能引入農(nóng)藥殘留污染，金線蓮也不例外。目前，雖然快速繁殖金線蓮巳取得成功，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，但是在培養(yǎng)過程非常容易受到微生物污染。在金線蓮栽培過程中，常需要噴灑多菌靈、甲基托布津、新植霉素（鏈霉素和土霉素的混齊」，由于在本實(shí)驗(yàn)條件下，鏈霉素未出峰，所以文章只探討了土霉素的測(cè)定）等殺菌，這類物質(zhì)對(duì)熱、酸、堿和光都很穩(wěn)定，在自然環(huán)境中降解較慢，在土壤和植物上易殘留，對(duì)人、畜都有一定的毒副作用。有研究表明，多菌靈可引起抽搐、精神恍惚、惡心嘔吐、胸悶、頭暈等癥狀，甚至對(duì)老鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。甲基托布津可以和人體血清白蛋白相互作用，誘導(dǎo)人體淋巴細(xì)胞DNA損傷，也是可疑致癌物之一。土霉素對(duì)胃、腸、肝臟、牙齒等具一定的損害，還會(huì)造成過敏反應(yīng)、二重感染、致畸作用等。在金線蓮使用中，常用的方法有泡飲、燉湯、加上水煎煮提取，隨著有效成份的獲得，有害的殘留農(nóng)藥也進(jìn)入其中，為保證金線蓮的質(zhì)量和用藥安全，對(duì)金線蓮進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析十分必要。 本章節(jié)根據(jù)多菌靈、甲基托布津、土霉素的理化性質(zhì)，考察了不同的提取方法、提取溶劑、凈化條件、色譜條件，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定金線蓮中多菌靈、甲基托布津、土霉素殘留量的分析方法，該方法操作簡(jiǎn)便，樣品凈化滿足液相色譜的檢測(cè)要求，結(jié)果重復(fù)性較好，回收率為85.40%-94.28%。 1、主要儀器與試藥 1.1 主要儀器 Agilent TC-Cl8（ODS）色譜柱（5μm，4.6*250mm，美國(guó)Agilent公司） LC-20Atvp高效液相色譜儀（口本島津） CW-2000超聲一微波協(xié)同萃取儀（新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司） DJ-l0A型傾倒式粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司） RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠） LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠） SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司） 弗羅里硅土凈化小柱，500mg/6mL（上海月旭材料科技有限公司） 1.2 試劑 多菌靈（阿拉丁試劑公司，含量99%；） 甲基托布津（阿拉丁試劑公司，含量99%；） 土霉素（阿拉丁試劑公司，含量97%；） 10個(gè)產(chǎn)地金線蓮：福建南靖、德化、武平、永春、邵武、華安、江西、四川、廣西、云南；經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室張永紅教授鑒定 甲醇、乙睛為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 乙酸乙醋、丙酮為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水 2、實(shí)驗(yàn)方法 2.1 色譜分離條件 色譜柱：Agilent TC-C18（25cm*4.6mm，5μm）； 流動(dòng)相：A為0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（（pH=4），B為乙睛； 梯度洗脫程序：0-10min，5%-5% B；10-20min，5%-45% B；20-40min，45%-45% B； 檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；柱溫：30℃； 流速：1mL/min； 進(jìn)樣量：20μL。 2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取多菌靈、甲基托布津、土霉素對(duì)照品適量，用乙睛配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的混合儲(chǔ)備溶液，進(jìn)而再稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg/mL的一系列混合對(duì)照品溶液。 2.3 供試品的制備和處理 精密稱取過80目篩的金線蓮粉末5.00g于50mL塑料離心管中，加入乙睛（含0.1%乙酸）溶液20mL，超聲提取30min，低速離心l0min，將上清液倒入圓底燒瓶中，殘?jiān)?0mL乙睛（含0.1%乙酸）溶液重復(fù)提取2次，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用5mL乙睛溶解作為供試品溶液。取供試品溶液1mL加入預(yù)先用乙酸乙醋活化的弗羅里硅土凈化小柱中，待樣品提取液到達(dá)小柱填料界面時(shí)，用10mL乙睛（含0.1%乙酸）-乙酸乙醋（體積比1：1，下同）淋洗固相萃取小柱，收集流出液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1mL流動(dòng)相溶液溶解，過0.45μm微孔濾膜，待HPLC檢測(cè)。 3、結(jié)果與討論 3.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)多菌靈、甲基托布津、土霉素在各種溶劑中的溶解度，選取了乙睛、甲醇、含0.1%乙酸的乙睛作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含0.1%乙酸的乙睛提取的樣品回收率較高，重現(xiàn)性較好，去除了大部分脂質(zhì)和色素。而選用純乙睛和純甲醇提取時(shí)，樣品回收率稍差，并且甲醇提取出的雜志較多，給凈化帶來較大的難度。多菌靈易溶于無機(jī)酸及乙酸、而甲基托布津、土霉素在酸性溶液中都較穩(wěn)定，加入0.1%乙酸，有利于提取和分析且樣品中殘留的干擾物質(zhì)相對(duì)較少，因此實(shí)驗(yàn)選取含0.1%乙酸的乙睛作為提取溶劑。 3.2 樣品凈化方法的選擇 農(nóng)藥殘留分析是對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的痕量組分進(jìn)行分析，因此樣品提取液需進(jìn)行有效凈化，避免干擾測(cè)定。若采用傳統(tǒng)的液/液萃取的凈化方法，消耗溶劑量大，易形成乳狀液，手工操作較為繁瑣，故實(shí)驗(yàn)采用固相萃取技術(shù)對(duì)金線蓮樣品提取液進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)C18柱，弗羅里硅土柱的凈化效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明弗羅里硅土柱的凈化效果優(yōu)于C18柱，其對(duì)雜質(zhì)、色素的的凈化效果較好。另外淋洗液的極性對(duì)凈化效果影響較大，選用極性較大的淋洗液，大量雜質(zhì)將被淋洗出，不利于雜質(zhì)的去除，而選擇小極性的淋洗液則不利于農(nóng)藥的淋出，采用乙睛（含0.1%乙酸）一乙酸乙醋混合洗脫劑對(duì)多菌靈、甲基托布津、土霉素的洗脫能力優(yōu)于乙睛、乙酸乙醋、甲醇、二氯甲烷等單一溶劑，對(duì)多菌靈、甲基托布津的回收率均達(dá)到90%以上，土霉素的回收率為85%。 3.3 色譜條件的優(yōu)化 3.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 在紫外分光光度計(jì)上對(duì)多菌靈、甲基托布津、土霉素對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)所得紫外吸收光譜可見，多菌靈分別在206nm/和282nm處有最大吸收，甲基托布津在264nm處有最大吸收，土霉素在270nm/和355nm處有最大吸收，綜合考慮3種待測(cè)組分的最大紫外吸收，選定波長(zhǎng)為270nm，在該波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，保證了3種待測(cè)組分均具有較好的響應(yīng)值。 3.3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)研究了不同流動(dòng)相及比例對(duì)3種待測(cè)組分的分離效果：由于多菌靈、甲基托布津與土霉素極性差別較大，為了使色譜峰出峰時(shí)間適中，故采用了梯度洗脫方法，梯度程序見“2.1項(xiàng)”；實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇一乙酸按緩沖溶液、乙睛-乙酸按水緩沖溶液、乙睛-1%甲酸水溶液、乙睛-磷酸鹽緩沖溶液等四種不同流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-乙酸按緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)，3種待測(cè)組分，雖然分離度較好，但是洗脫速度慢，土霉素的色譜峰出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾且檢測(cè)靈敏度低；把甲醇換成乙睛時(shí)，未見土霉素拖尾現(xiàn)象得到改善；當(dāng)流動(dòng)相組合換成乙睛-1%甲酸水溶液時(shí)，在檢測(cè)土霉素時(shí)，有效地減少固定相中殘留的硅烷醇的干擾，降低了土霉素的去質(zhì)子化作用，能夠減小土霉素拖尾，但是多菌靈和土霉素分離效果較差；進(jìn)而把1%甲酸水溶液換成磷酸鹽緩沖溶液，并調(diào)節(jié)pH=4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種待測(cè)組分在該流動(dòng)相及上述梯度條件下，能夠較好地分離開，減小各色譜峰拖尾，改善峰形，而且保留時(shí)間適中，避免因?yàn)槌龇暹^快而易受到樣品中雜質(zhì)峰的干擾，適合復(fù)雜基質(zhì)樣品的測(cè)定。圖4-1（A，B，C）多菌靈、甲基托布津與土霉素對(duì)照品溶液、空白金線蓮樣品及空白樣品加標(biāo)的色譜圖。 3.4 線性范圍、檢出限與定量下限 吸取混合對(duì)照品系列溶液，進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣3次，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度XCX：μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。多菌靈、甲基托布津與土霉素的線性關(guān)系及方法檢出限及定量限見表4-1。 3.5 回收率與精密度 在未檢出多菌靈、甲基托布津和土霉素的空白金線蓮中準(zhǔn)確加入一定量的高、中、低三種濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1，2.3項(xiàng)方法進(jìn)行提取、凈化、測(cè)定，計(jì)算各農(nóng)藥的回收率，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，結(jié)果見表4-2。各農(nóng)藥的平均加樣回收率在85.40%-94.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3.32%-8.13%之間，滿足農(nóng)藥多殘留分析的要求。 3.6 樣品檢測(cè) 采用該檢測(cè)方法以及提取條件對(duì)10批不同產(chǎn)地的金線蓮樣品進(jìn)行提取、凈化、測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均未檢測(cè)到多菌靈、甲基托布津與土霉素三種農(nóng)藥的殘留。 4、結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)探索確定了提取方法、凈化條件、色譜條件，首次建立了同時(shí)測(cè)定金線蓮中多菌靈、甲基托布津、土霉素殘留量的分析方法液相色譜測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)要求，為金線蓮的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制定提供了依據(jù)。
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