自殺性質粒載體：一般用于基因突變。將突變的目的基因克隆到自殺性質粒載體上，通過接合等使其進入宿主，由于在宿主菌中不存在復制基因啟始所需的復制蛋白（如Pi蛋白等），其無法復制，在外界選擇性壓力的作用下,自殺性質粒載體所攜帶的突變基因就與宿主染色體上的野生型發(fā)生基因發(fā)生二次同源重組，產生了帶有突變的突變株；而質粒載體自身由于自殺性特性連同染色體上原有的野生型基因一起隨著細菌的傳代從菌體內消失。至于一次重組的突變株，可借助質粒上的某些選擇基因（如sacB，sucrose敏感）篩除。

整合載體：將目的基因克隆于質粒載體上，進而整合到宿主染色體，是克服質粒不穩(wěn)定性的一個有效途徑。

一、關于載體

自殺性質粒載體完全可與自己構建，只要保證兩點：

（一）自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行復制，也就是說載體上不能有能在宿主菌中復制的復制子。

自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行復制，否則會導致細菌染色體突變株的構建失敗。但是在構建時，要注意以下方面：

1、在制備質粒載體和DNA插入片斷時：2ug 5kb大小的線狀DNA大約含有1.4poml/L5'末端磷酸。5‘突出端脫磷需要CIP0.01u/pmolDNA末端，平端或凹陷脫磷需CIP0.5u/pmolDNA末端。

2、連接質粒載體和DNA插入片斷時：

（1）初次實驗的可以建立幾種不同的連接體系，比如插入片段與載體分子數比率可以為3：1，1：1，或1：3。

（2）可以嘗試三種溫度和時間的連接如4度，過夜；15度，4－6小時；25度，1小時。

3、細菌轉化和篩選時：

（1）陽性對照：如果是感受態(tài)細胞，－80度儲存的在5－6周后,轉化率低。可用一已知標準閉環(huán)質粒鑒定感受態(tài)細胞的轉化能力。

（2）陰性對照：用無DNA轉化物的感受態(tài)細菌鋪板，如果有菌落生長，說明其中抗生素濃度不夠，或是感受態(tài)污染

（二）篩選標記

二、園友們的經驗與建議

1、一般不需要有能誘導表達的重組酶基因來進行有效地同源重組。除非你的菌株是重組缺限型的，這另當別論。當然，在做自殺性質粒是需要考慮交換臂的長度，臂越長突變菌株越容易得到，篩先的工作量越少。一般，在交換的雙臂保證有1kb左右的同源序列，可提高其交換效率。

2、Q:如果我想構建枯草芽胞桿菌的某個基因的突變株,(1)在體外將該基因進行突變;(2)在該突變因兩端接上與染色體上該基因兩端相同的核苷酸序列;(3)將該DNA片段重組入某大腸桿菌的質粒中;(4)將重組質粒線性化;(5)將線性化的質粒電轉化至枯草桿菌;篩選重組子..通過上述6個步驟是否能通過同源重組完成枯草桿菌突變株的構建?(園友qzh21sohu)

A:（1)自殺質粒構建好后，不必線性化，可直接轉入受體菌。

(2)按這6個步驟可以得到陽性克隆，但是你無法篩選，因為我沒有在你的步驟中發(fā)現篩選標記（如抗生素抗性），一般這個篩選標記是在要突變的基因中間的。不過如果你不是基因失活，而只是點突變，那就不能將篩選標記放在突變基因中間，而應該與它緊鄰，在突變基因和篩選標記兩端加上相應的同源序列（1kb左右）。不過這樣還有一個問題，就是你要突變的基因是單順反子還是多順反子，如果是多順反子，那它所處的位置怎樣？因為你要考慮不影響到其他基因的轉錄與翻譯。請仔細檢查。

(3)不同的菌要用不同的自殺質粒，因為自殺質粒是因其不能在受體菌中復制而得名的。不過你要先試一下這個質粒在芽孢桿菌中能否復制。

(4)在網上查查相關文獻就好了，肯定有實驗步驟。我們都是這樣做的。

3、不是什么菌都可以做成高效率的感受態(tài)的。自殺載體如果沒有mob位點，該用什么方法導入（結合）到受體菌中呢？園友wuji建議一種方法：噬菌體轉導。我?guī)熋镁褪怯肂acteriophage P22往Salmonella中導入該質粒。