MTT實驗總結

lipy@% 2011-05-12

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MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。
MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。

MTT

步驟如下：
1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔
1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

2:培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天（可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間）。

3：呈色：培養(yǎng)3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.
繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。

4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

注意事項：
（1）選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。
（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
（3）設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。
MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！

舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入
計算公式：
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025

有一個公式可供參考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm:最大陽性反應率
Pn:最小陽性反應率

抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率

例：
用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定

一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。

一般要低于IC50，避免非調(diào)亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調(diào)亡率應低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細胞周期的亞G0峰比較明顯.