細(xì)胞調(diào)亡與壞死鑒別的簡便方法   midas

1、PI和Hoechst33342雙標(biāo)：

PI、Hoechst33342均可與細(xì)胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但是PI不能通過正常的細(xì)胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細(xì)胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細(xì)胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細(xì)胞和中早期調(diào)亡細(xì)胞均可被Hoechst著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細(xì)胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。 故PI著色為壞死細(xì)胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細(xì)胞。我最近在作的試驗就是用的這種方法，附上一張我染的PC12細(xì)胞的圖片，請大家指教。更精確的定量可以通過流式細(xì)胞儀來檢測。用PI和Hoechst33342雙標(biāo)鑒別調(diào)亡、壞死，這種方法簡便易行，結(jié)果比較可靠。

2、PI和Calcein-Am雙標(biāo)：

Calcein-AM 是一種綠色熒光標(biāo)記物，可顯示胞漿，為膜通透性的熒光染料。Calcein-AM 一旦進入胞內(nèi)，便可被內(nèi)源性酯酶水解成綠色熒光物質(zhì)calcein, 并保留在胞漿中。細(xì)胞處于調(diào)亡時，由于核成碎片狀，從而使此時的胞漿的calcein著色呈碎片狀，但是PI為陰性。細(xì)胞壞死時，胞漿的calcein染色基本上屬于正常，但是PI為陽性，有時可以看到膜內(nèi)有空泡。但是晚期調(diào)亡細(xì)胞，胞漿有calcein著色并呈碎片狀，而且PI為陽性。

3、PI和Annexin-V雙標(biāo)：

Annexin-V（green）可以和胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合。正常細(xì)胞膜的磷脂雙分子層排列整齊，但是如果細(xì)胞損傷時，酯脂雙分子層的排列就會被打亂，內(nèi)層的可能會翻轉(zhuǎn)到外層，Annexin-V就可以檢測到這種現(xiàn)象。因此細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細(xì)胞可能為陰性）。但是只有壞死的細(xì)胞PI是陽性。

可用confocal來進行雙標(biāo)觀察計數(shù)或流式細(xì)胞儀定量檢測。

4、Leukostat染色：

活細(xì)胞Leukostat染色，核呈棕色，胞漿透明；調(diào)亡細(xì)胞核濃集，呈黑、褐色，變小，胞漿不可見；壞死細(xì)胞溶解呈空殼。 這種方法現(xiàn)在少用。

補充：鑒別細(xì)胞調(diào)亡與壞死的方法挺多，但大多比較繁瑣，我總結(jié)的這幾種方法則是簡便易行，最適合于經(jīng)費比較緊張的研究生們。

針對朋友的提問，回答如下：

1、試劑來源： PI和Hoechst33342都是sigma公司的粉劑，不是kit，

2、具體方法： 將PI和Hoechst33342的終濃度調(diào)到10μg/mg就行，用PBS，Hank's液、生理鹽水或D液任何一種溶解都可以。Hoechst33342染色37℃10min就達到飽和，PI在4℃10~20min就行。