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結(jié)果： 通過對整個基因表達(dá)譜的分析，作者獲得了廣泛差異表達(dá)的全面概述。隨后對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，揭示其主要參與關(guān)鍵代謝途徑和功能。隨后，作者將該數(shù)據(jù)與代謝基因相關(guān)聯(lián)以構(gòu)建代謝相關(guān)表達(dá)矩陣。作者對該基質(zhì)進(jìn)行了差異表達(dá)分析，鑒定了與代謝相關(guān)的DEG（圖1A）。餅圖結(jié)果顯示了不同代謝途徑中差異基因的分布（圖1B）。差異表達(dá)代謝相關(guān)基因的生存分析生存分析得到15個與預(yù)后顯著相關(guān)的基因。預(yù)后基因與差異代謝相關(guān)基因的隨后關(guān)聯(lián)導(dǎo)致鑒定出與代謝和預(yù)后相關(guān)的六個關(guān)鍵DEG：G6 PD、SLC 16 A3、LPCAT 1、SLC 2A 1、PFKFB 4、DGAT 2L 6（圖1C）。這些基因的過表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險增加有關(guān)。通過Kaplan-Meier曲線的進(jìn)一步分析和驗證證實，這六個關(guān)鍵基因的過表達(dá)可能導(dǎo)致肝癌患者的預(yù)后較差（p< 0.01）（圖1D）。關(guān)鍵基因的免疫相關(guān)發(fā)現(xiàn)先前的研究表明，癌癥中的代謝重編程與免疫反應(yīng)有關(guān)，包括免疫細(xì)胞分化和功能[26-28]。通過作者對6個代謝相關(guān)關(guān)鍵基因與免疫評分、間質(zhì)評分和腫瘤純度之間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在肝癌腫瘤微環(huán)境中，SLC 16 A3與免疫評分呈正相關(guān)，與腫瘤純度呈最強(qiáng)負(fù)相關(guān)。這強(qiáng)調(diào)了SLC 16 A3在肝癌的腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵作用（圖2A）。隨后，通過這六個關(guān)鍵基因與各種免疫細(xì)胞類型的進(jìn)一步相關(guān)性分析，作者發(fā)現(xiàn)SLC 16 A3和M0巨噬細(xì)胞之間存在顯著的正相關(guān)性（圖2B）。這促使作者關(guān)注SLC16A3，以進(jìn)一步分析其對腫瘤進(jìn)展和治療的影響?；赟LC16A3的中位表達(dá)，作者將患者分為兩組。作者觀察到具有高表達(dá)的SLC 16A3的患者傾向于具有較高比例的M0巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤，這與免疫抑制相關(guān)（圖2C）。接下來，作者檢查了SLC16A3在各種免疫相關(guān)因子中的表達(dá)模式（圖2D）。在SLC16A3過表達(dá)與TOX、PDCD1、TIGIT、CTLA4和HAVCR 2表達(dá)的上調(diào)之間觀察到顯著關(guān)聯(lián)?？偟膩碚f，作者的研究確定了一個與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的代謝相關(guān)基因SLC16A3，為深入了解SLC16A3與HCC內(nèi)免疫景觀之間的相互作用提供了見解。SLC16A3與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析作者基于SLC16A3和CD68的表達(dá)水平將樣品分成四個亞組：CD68和SLC16A3兩者的低表達(dá)、CD68的低表達(dá)和SLC16A3的過表達(dá)、CD68的過表達(dá)和SLC16A3的低表達(dá)、以及CD68和SLC16A3兩者的過表達(dá)（圖3A）。對每個亞組進(jìn)行存活分析，揭示了以CD68和SLC16A3兩者的低表達(dá)為特征的紫色亞組表現(xiàn)出最佳預(yù)后，其次是具有CD68過表達(dá)和SLC16A3低表達(dá)的亞組（圖3B）。這些生存曲線表明，SLC16A3過表達(dá)可能導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良。隨后，作者對這四個亞組中各種免疫因子的表達(dá)水平進(jìn)行了綜合分析（圖3C）。箱形圖清楚地示出了GZMA、GZMB、IFNG、TOX、F0XP3、PDCD1、TIGIT、LAG3、CTLA 4和HAVCR 2的表達(dá)水平的顯著差異，其由SLC16A3表達(dá)調(diào)節(jié)，特別是在具有較高數(shù)量的巨噬細(xì)胞的情況下。值得注意的是，即使當(dāng)巨噬細(xì)胞計數(shù)較低時，在上調(diào)和下調(diào)的SLC16A3組之間仍然存在TOX、PDCD1、TIGIT、CTLA4和HAVCR 2表達(dá)的顯著差異，表明在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞數(shù)量后，由SLC16A3過表達(dá)誘導(dǎo)的抑制狀態(tài)持續(xù)存在。隨后，使用基于SLC16A3和⑶ 3的表達(dá)水平的類似方法，作者將樣品再分成四組（圖3D，E）。結(jié)果表明，盡管T細(xì)胞的數(shù)量存在變化，但SLC 16 A3的上調(diào)和下調(diào)仍然與PDCD 1、CTLA 4和HAVCR 2表達(dá)的調(diào)節(jié)顯著相關(guān)，這意味著對免疫抑制的顯著影響（圖3F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，即使在校正T細(xì)胞的量后，SLC16A3誘導(dǎo)的免疫抑制作用仍持續(xù)存在。為了進(jìn)一步驗證SLC16A3與巨噬細(xì)胞計數(shù)和T細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)系，作者選擇其中一個方向作為作者的主要研究重點，并進(jìn)一步研究了SLC16A3與巨噬細(xì)胞計數(shù)之間的關(guān)系。 SLC16A3與巨噬細(xì)胞亞群相關(guān)通路為了闡明SLC 16 A3介導(dǎo)的免疫抑制背后的機(jī)制，作者隨后進(jìn)行了所有基因與CD 68以及SLC 16 A3之間的關(guān)聯(lián)分析。作者鑒定了與SLC 16 A3和巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因，并基于它們的相關(guān)性將它們分為四個亞組（圖4A）。這些亞組包括與SLC 16 A3高度正相關(guān)且與CD 68負(fù)相關(guān)的基因（區(qū)域I）;與SLC 16 A3和CD 68高度正相關(guān)的基因（區(qū)域II）;與CD 68高度正相關(guān)且與SLC 16 A3負(fù)相關(guān)的基因（區(qū)域III）;以及與SLC 16 A3和CD 68低相關(guān)的基因（區(qū)域IV）。作者主要關(guān)注的是前三個亞組。功能富集分析顯示，區(qū)域I中的基因主要與肌動蛋白絲組織、細(xì)胞粘附的正調(diào)控和細(xì)胞組分分解相關(guān)（圖4 B）。這些代謝途徑主要促進(jìn)細(xì)胞粘附和降解。細(xì)胞粘附的正向調(diào)節(jié)可有效促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展[29]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個非常復(fù)雜的動態(tài)過程，跨越多個時空尺度，并涉及基于力-化學(xué)發(fā)生耦合相互作用的分子水平上的各種蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞骨架聚合、組裝、解聚和重塑機(jī)制。因此，肌動蛋白絲途徑的富集進(jìn)一步表明遺傳改變在腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮作用[30]。區(qū)域II中的基因在與調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞粘附、白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、T細(xì)胞活化和白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)的途徑中富集（圖4C）。這些途徑的富集表明先天免疫機(jī)制在腫瘤內(nèi)被激活，有效地激活T細(xì)胞免疫殺傷，從而抑制腫瘤進(jìn)展。在區(qū)域III中，基因主要與免疫應(yīng)答的活化、T細(xì)胞活化和白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)（圖4D）。整個途徑的富集結(jié)果表明，免疫反應(yīng)被激活，有效促進(jìn)了抗腫瘤反應(yīng)。這表明在低SLC 16 A3表達(dá)的條件下，肝癌微環(huán)境具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答激活的潛力。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，SLC16A3和巨噬細(xì)胞之間的相互作用與肝癌微環(huán)境中細(xì)胞粘附，免疫應(yīng)答激活和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的功能相關(guān)的途徑的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。
SLC 16 A3的表達(dá)與T細(xì)胞功能障礙相關(guān)為了研究SLC16A3在免疫微環(huán)境中的作用，作者從10名原發(fā)性肝癌患者收集了額外的單細(xì)胞數(shù)據(jù)（圖5A）。在聚類和降維后，鑒定了總共8種細(xì)胞亞型（圖5B）?；诮?jīng)典細(xì)胞標(biāo)志物，作者鑒定了肝細(xì)胞（亞型0、3、7）、巨噬細(xì)胞（亞型1）、T細(xì)胞（亞型2、6）、內(nèi)皮細(xì)胞（亞型4）和平滑肌細(xì)胞（亞型5）（圖5C）。有趣的是，作者觀察到SLC16A3主要在巨噬細(xì)胞內(nèi)的顯著表達(dá)（圖5D）。隨后，基于SLC16A3在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平，作者將10個樣品分為兩組：SLC16A3_高和SLC16A3_低（圖5E）。然后，作者比較了這兩組之間的T細(xì)胞的功能狀態(tài)。結(jié)果證明來自SLC16A3_high樣品的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性分子如GZMB、GZMA和IFNG的表達(dá)顯著降低（圖5F）。相反，某些免疫檢查點分子如CTLA4、LAG3和TIGIT的表達(dá)升高（圖5F）。IHC實驗證實了表達(dá)SLC16A3的巨噬細(xì)胞的存在（圖5G）。同時，在SLC16A3高表達(dá)的區(qū)域中，GZMB+細(xì)胞的浸潤比例顯著降低（圖5H）。 考慮到巨噬細(xì)胞狀態(tài)的多樣性，作者分析了SLC16A3在不同巨噬細(xì)胞狀態(tài)中的表達(dá)。巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步聚集導(dǎo)致14種細(xì)胞亞型（圖6A、B）。作者觀察到SLC 16A3主要在M11、M8、M4和M1中以高水平表達(dá)（圖6C）。其中，M11表現(xiàn)出金屬硫蛋白的高表達(dá)，M4表達(dá)EREG，其促進(jìn)腫瘤生長[31]。M1的特征是SPP 1的高表達(dá)，先前的研究將其與不良預(yù)后相關(guān)[24]。 差異分析表明，SLC 16 A3+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出促進(jìn)遷移、侵襲和腫瘤血管生成的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如SPP 1和MMP 9）以及與糖酵解相關(guān)的基因（包括PKM）的高表達(dá)（圖6D）[24，32-35]。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，腫瘤促進(jìn)的SLC 16 A3巨噬細(xì)胞表達(dá)可能導(dǎo)致T細(xì)胞功能受損，從而有助于建立免疫抑制微環(huán)境。
SLC16A3+巨噬細(xì)胞在腫瘤侵襲前沿富集接下來，作者檢查了SLC16A3+巨噬細(xì)胞的空間分布特征。作者從先前發(fā)表的文章中收集了三個樣本的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，每個樣本包含腫瘤和正常區(qū)域[25]。在對每個樣品的斑點進(jìn)行降維聚類后，這三個樣品顯示出正常和腫瘤區(qū)域之間的典型過渡區(qū)。隨后，作者分析了這些區(qū)域中SLC16A3和CD68的空間表達(dá)，使用兩者的幾何平均值來確定SLC16A3+巨噬細(xì)胞的分布特征（圖7A）。結(jié)果表明，這些SLC16A3+巨噬細(xì)胞主要集中在腫瘤前沿的移行區(qū)，并在移行區(qū)之前的正常區(qū)域中有一些分布（圖7B），表明SLC16A3+巨噬細(xì)胞可能為腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增和侵襲性生長創(chuàng)造條件[36]。
抑制SLC16A3通過增強(qiáng)免疫抑制肝癌細(xì)胞增殖作者建立了小鼠肝細(xì)胞癌（HCC）的皮下腫瘤模型，并利用SLC16A3抑制劑（MCT4i）來研究SLC16A3在HCC進(jìn)展中的作用（圖8A）。結(jié)果顯示，注射MCT 4i的小鼠的腫瘤體積生長速率顯著低于對照組（圖8B）。對獲得的皮下腫瘤稱重顯示，MCT 4i組的腫瘤質(zhì)量顯著低于對照組（圖8C）。分別通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤GZMB標(biāo)志物，顯示MCT 4i組中GZMB表達(dá)的顯著上調(diào)（圖8D，E），表明抑制SLC 16 A3可有效增強(qiáng)免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力。最后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MCT 4 i組中CD 8細(xì)胞的PD-1表達(dá)顯著降低（圖8 F），表明抑制SLC 16 A3靶標(biāo)可有效減少T細(xì)胞耗竭。另外，作者發(fā)現(xiàn)在MCT 4 i組中CD 206+巨噬細(xì)胞顯著減少（圖8 G）。這些結(jié)果表明，抑制SLC 16 A3可以創(chuàng)造一個有利的免疫微環(huán)境，減緩肝細(xì)胞癌的增殖。
總結(jié) 總的來說，作者的研究確定了一種代謝相關(guān)基因SLC16A3，它與腫瘤微環(huán)境相關(guān)，并通過體內(nèi)實驗驗證了其在腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制功能，從而深入了解了SLC16A3與HCC內(nèi)免疫景觀之間的相互作用。SLC16A3表達(dá)的促腫瘤巨噬細(xì)胞可能與T細(xì)胞功能障礙和腫瘤侵襲。作者的研究結(jié)果提出了潛在的治療策略，旨在利用SLC16A3對腫瘤微環(huán)境的影響，為HCC患者開發(fā)更有效的治療方法并改善其預(yù)后。
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