基于16S rRNA測序和RT-qPCR的硫化礦物表面微生物群落組成分析

Analysis of Microbial Community Composition on Sulfide Mineral Surface Based on 16S rRNA Sequencing and RT-qPCR

黃珊珊¹，馬麗媛^{2, 3, *}，劉學端^{1, 3}

¹資源加工與生物工程學院，中南大學，長沙，湖南；²環(huán)境學院，中國地質(zhì)大學（武漢），武漢，湖北；³生物冶金教育部重點實驗室，中南大學，長沙，湖南

*通訊作者郵箱: maly@cug.edu.cn

引用格式：黃珊珊, 馬麗媛, 劉學端. (2021). 基于16S rRNA測序和RT-qPCR的硫化礦物表面微生物群落組成分析. // 微生物組實驗手冊. Bio-101: e2003690. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003690.

How to cite: Yunyun Gao, Kai Peng, Defeng Bai, et al. 2024. The Microbiome Protocols eBook initiative: Building a bridge to microbiome research. iMeta 3: e182. https:///10.1002/imt2.182

摘要: 金屬硫化物礦山具有pH值低、重金屬含量高等特點，為通過氧化亞鐵和無機硫獲取能量的冶金微生物提供了獨特的寡營養(yǎng)生態(tài)位，其中嗜酸硫桿菌屬（Acidithiobacillus）內(nèi)不同種具有不同的鐵硫氧化功能，是酸性礦山環(huán)境及冶金過程的代表性優(yōu)勢屬。16S rRNA擴增子測序是研究微生物群落組成及多樣性的重要手段，但無法根據(jù)測序結(jié)果對Acidithiobacillus在種水平上加以區(qū)分。實時熒光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）因特異性好，靈敏度高，已成為現(xiàn)今物種定量分析的主流技術(shù)之一。為準確刻畫浸礦過程中硫化礦物表面具有不同鐵硫氧化功能的冶金微生物群落組成規(guī)律，本文將16S rRNA測序與RT-qPCR技術(shù)相結(jié)合，提出了一種高效精確的冶金微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，能夠在種水平區(qū)分高豐度的鐵硫氧化功能類群，對研究微生物群落氧化硫化礦物的過程機理以及指導工業(yè)菌群的優(yōu)化調(diào)控具有重要意義。

關(guān)鍵詞: 酸性礦山，礦物表面，微生物，16S rRNA測序，RT-qPCR

材料與試劑

1.50 ml離心管（Corning，catalog number: 352070）

2.10 ml離心管（CNWTC，catalog number: TYA04）

3.5 ml離心管（Eppendorf，catalog number: 0030119401）

4.1.5 ml尖底離心管（Fisher Scientific，catalog number: 05-408-129）

5.各種型號槍頭（20 μl，200 μl，1 ml）

6.0.2 mm玻璃珠

7.2×SYBR Green qPCR Master Mix核酸染料

8.96孔PCR板（Axygen，PCR-96-FLT-C）

9.(NH₄)₂SO₄

10.K₂HPO₄

11.KCl

12.Ca(NO₃)₂

13.MgSO₄·7H₂O

14.乙醇（96%-100%）

15.瓊脂糖

16.TBE緩沖液（0.5x）

17.雙鏈DNA高靈敏度熒光定量試劑盒（Invitrogen，catalog number: Q32851）

18.TIANamp^? Bacteria DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech，catalog number: DP302），含有以下組分：

1)吸附柱CB3

2)收集管（2 ml）

3)緩沖液GA

4)緩沖液GB

5)緩沖液GD

6)緩沖液PW

7)緩沖液TE

8)蛋白酶K

19.溶菌酶緩沖液（20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na₂EDTA；1.2% Triton；終濃度為20 mg/ml的溶菌酶）

20.9K培養(yǎng)基（見溶液配方）

21.瓊脂糖凝膠（見溶液配方）

儀器設備

1.燒杯

2.移液槍

3.分析天平

4.高速離心機

5.光學顯微鏡

6.渦旋混合器

7.電泳儀

8.NanoDrop-1000微量分光光度計

9.Qubit 2.0核酸蛋白定量儀

10.Illumina Miseq測序平臺

11.Veriti 96-well Fast Thermal Cycler梯度PCR儀 （Thermo Fisher，model: 4375786）

12.Bio-rad iCycler iQ實時定量PCR監(jiān)測系統(tǒng)

實驗步驟

1.礦物表面微生物收集

1.1充分振蕩混勻含有微生物的固液混合樣品，吸取5 ml置于10 ml離心管中，2,000 × g離心2 min。

1.2離心后棄上清，或轉(zhuǎn)至另一新的10 ml離心管中，以收集浸出液中的游離微生物。

1.3利用25 ml新鮮9K培養(yǎng)基，將離心管底部礦物樣品重懸至50 ml離心管中。

1.4向管中加入1 g直徑0.2 mm玻璃珠，然后在渦旋混合器上振蕩5 min。

1.5將上清液轉(zhuǎn)移至收集管中，并在光學顯微鏡下檢查是否有微生物細胞。

1.6重復上述礦物樣品重懸步驟，直至上清液中未觀察到細胞存在，則吸附在礦物表面微生物已被完全洗脫下來。

1.7分別將含有游離微生物和吸附微生物的上清液在12,000 × g轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄上清。

1.8加入1 ml新鮮9K培養(yǎng)基，重新懸浮菌體，將其轉(zhuǎn)入新的1.5 ml尖底離心管

中，12,000 × g離心2 min，棄上清。

1.9重復步驟1.8 3-5次，以去除浸出液中殘留的重金屬離子和微細粒礦渣，避免對DNA提取造成影響。

1.10立即采用試劑盒對微生物菌體細胞進行DNA提取。

注：應盡量去除體系中的重金屬離子和微細粒礦渣，防止提取的DNA片段較

小或質(zhì)量下降。

2.DNA提取

使用TIANamp^? Bacteria DNA提取試劑盒進行DNA的提取，具體步驟如下：

2.1向步驟1.9所得的菌體中加入100 μl緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮；加入100 μl溶菌酶緩沖液，37 °C溫育30 min；加入20 μl蛋白酶K，吸打混勻；加入220 μl緩沖液GB，振蕩約15 s后，70 °C放置10 min以上。

注：若緩沖液GA或GB中有沉淀，可在37 °C水浴至溶解，搖勻后使用。

2.2 加入220 μl乙醇（96-100%），充分震蕩約15 s后，加入吸附柱CB3中（吸 附柱放入2 ml收集管中），13,400 × g離心30 s，丟棄廢液。

2.3 向吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD（使用前確保已加入96-100%乙醇）， 13,400 × g離心30 s，丟棄廢液。加入600 μl緩沖液PW（使用前確保已加 入96-100%乙醇），13,400 × g離心30 s，丟棄廢液。重復加入緩沖液PW 并離心棄廢液。

2.4 采用13,400 × g離心2 min，將吸附柱CB3放置于一個干凈的1.5 ml離心 管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加80 μl洗脫緩沖液TE。室溫放置2-5 mi n，13,400 × g離心2 min，此時上清液中即含有基因組DNA。

注：DNA提取完成后置于-20 °C保存，應盡量避免反復凍融，以防止降解。

3.群落組成分析

3.1高通量測序

1）使用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增DNA樣本的16S rRNA基因V4區(qū)，PCR反應條件為：94 °C預變性5 min后，進行28個循環(huán)（94 °C變性45 s，62 °C退火45 s，72 °C延伸1 min），最后在72 °C下延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用于文庫構(gòu)建，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后采用PE300測序策略于 Illumina Miseq測序平臺進行高通量測序（詳見Ma 等, 2018）。

3.2RT-qPCR

1）標準曲線的構(gòu)建

a.采用特異性引物（表1）對Acidithiobacillus屬內(nèi)四個優(yōu)勢種的基因組進行普通PCR擴增，普通PCR反應程序為：94 °C預變性3 min；[94 °C解鏈30 s，特異退火溫度（55 °C-59 °C）30 s，72 °C延伸1 min]（30個循環(huán)）；72 °C延伸5 min。測定PCR產(chǎn)物濃度并換算成拷貝數(shù)，作為標準品經(jīng)10倍梯度稀釋后，取10⁹-10² copies/μl稀釋樣品，以構(gòu)建不同種菌株的標準曲線。

b.拷貝數(shù)換算公式：拷貝數(shù)（copies/μl）=

注：其中c（ng/μL）為濃度；MW=堿基數(shù)目（bp）× 660（Daltons/bp）

表1. RT-qPCR擴增 Acidithiobacillus菌屬的特異性引物信息*

* Ma 等, 2017a; Ma 等, 2017b; Ma 等, 2018; Tao 等, 2018; Wang 等, 2020

2）RT-qPCR反應

a.基于Bio-rad iCycler iQ實時定量PCR監(jiān)測系統(tǒng)，采用四個優(yōu)勢種的特異性引物進行RT-qPCR擴增。反應體系（25 μl）包括：2×SYBR Green核酸染料，12.5 μl；上下游引物，各0.5 μl；雙蒸水，6.5 μl；cDNA模板，5 μl。反應條件為：95 °C，5 min；40個循環(huán)內(nèi)（95 °C，30 s；55-59 °C，30 s；72 °C，30 s）；95 °C，1 min；55 °C，10 s（其中55-59 °C為不同引物的特異退火溫度）；80個循環(huán)內(nèi)（自59 °C每個循環(huán)增加0.5 °C，至99 °C，每個循環(huán)10 s）；4 °C延伸，反應終止。每個樣品設置三個技術(shù)重復，同時每板設置三個陰性對照。

結(jié)果與分析

1.通過1.0%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop-1000微量分光光度計檢測礦物表面微生物DNA提取質(zhì)量，并利用雙鏈DNA高靈敏度熒光定量試劑盒在Qubit 2.0核酸蛋白定量儀上測定DNA濃度。

2.16S rRNA基因測序技術(shù)為微生物群落的組成及多樣性研究提供了強有力的工具，能夠識別已知和未知物種，但通常只能鑒定至屬水平（Lukhele 等, 2019）。據(jù)報道，酸性礦山環(huán)境物種多樣性相對較低，代表性優(yōu)勢類群約占微生物總量的90%，如既能氧化亞鐵又能氧化硫的嗜酸硫桿菌屬（Acidithiobacillus）和硫化桿菌屬（Sulfobacillus），僅能氧化亞鐵的鉤端螺旋菌屬（Leptospirillum）和鐵質(zhì)菌屬（Ferroplasma）。其中，Acidithiobacillus是廣泛存在于AMD環(huán)境的典型類群，該屬中嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans）和耐冷嗜酸硫桿菌（A. ferrivorans）能夠氧化亞鐵和硫獲取能量，而嗜酸氧化硫硫桿菌（A. thiooxidans）和嗜酸性喜溫硫桿菌（A. caldus）僅能夠通過氧化礦物中的硫獲得能量維持自身代謝（Chen 等, 2015; Méndez-Garcíaet 等, 2015）。RT-qPCR雖無法挖掘未知物種信息，但能夠?qū)σ阎锓N進行精確定量。

表2. 鐵硫富集群落在黃銅礦浸出過程中優(yōu)勢屬相對豐度

3.在分別利用富鐵少硫能源底物和富硫少鐵能源底物馴化菌群（分別命名為Fe-O和S-O）進行黃銅礦浸出實驗中，16S rRNA高通量測序結(jié)果表明，在各組中Acidithiobacillus均為絕對優(yōu)勢屬（＞60%），在Fe-O群落浸出初期占比甚至高達99%（表2），但鐵氧化菌或硫氧化菌在群落中的占比并不清楚。基于RT-qPCR精確定量結(jié)果，獲得A. ferrooxidans、A. ferrivorans、A. thiooxidans和A. caldus的擴增比例，帶入16S rRNA測序結(jié)果中Acidithiobacillus的相對豐度，計算屬內(nèi)四個優(yōu)勢種在整個樣本中的相對量，并將微生物群落組成以柱形圖展示。如圖1所示，Acidithiobacillus屬內(nèi)不同鐵硫氧化功能類群的相對豐度得以明確，在鐵富集浸出體系中，A. ferrooxidans和A. caldus為優(yōu)勢種，分別占30%-45%和30%-65%；而A. thiooxidans和A. ferrooxidans在硫富集浸出體系中占據(jù)主導地位，相對豐度分別約為50%和20%。因此，在16S rRNA測序的基礎上，聯(lián)合RT-qPCR技術(shù)精確定量Acidithiobacillus屬的不同功能類群，能夠更加全面揭示浸出過程中群落組成及演替規(guī)律，為冶金微生物的浸出行為及機理研究奠定基礎。（Ma 等, 2018; Tao 等, 2018）。

圖1. 鐵硫富集群落在黃銅礦浸出過程中群落演替規(guī)律

溶液配方

1.9K培養(yǎng)基

2.瓊脂糖凝膠（1%）

瓊脂糖               1 g

TBE緩沖液（0.5x）   100 ml

致謝

本工作的順利開展得益于國家自然科學基金項目（資助號：31570113和42007306）和中南大學生物冶金教育部重點實驗室基金（資助號：MOEKLB1702）的支持。

參考文獻

1.Chen, L. X., Hu, M., Huang, L. N., Hua, Z. S., Kuang, J. L., Li, S. J. and Shu, W. S. (2015). Comparative metagenomic and metatranscriptomic analyses of microbial communities in acid mine drainage. ISME J 9(7): 1579-1592.

2.Lukhele, T., Selvarajan, R., Nyoni, H., Mamba, B. B. and Msagati, T. A. M. (2019). Diversity and functional profile of bacterial communities at Lancaster acid mine drainage dam, South Africa as revealed by 16S rRNA gene high-throughput sequencing analysis. Extremophiles 23(6): 719-734.

3.Ma, L., Wang, X., Feng, X., Liang, Y., Xiao, Y., Hao, X., Yin, H., Liu, H. and Liu, X. (2017a). Co-culture microorganisms with different initial proportions reveal the mechanism of chalcopyrite bioleaching coupling with microbial community succession. Bioresour Technol 223: 121-130.

4.Ma, L., Wang, X., Tao, J., Feng, X., Zou, K., Xiao, Y., Liang, Y., Yin, H. and Liu, X. (2017b). Bioleaching of the mixed oxide-sulfide copper ore by artificial indigenous and exogenous microbial community. Hydrometallurgy 169: 41-46.

5.Ma, L., Wang, X., Liu, X., Wang, S. and Wang, H. (2018). Intensified bioleaching of chalcopyrite by communities with enriched ferrous or sulfur oxidizers. Bioresour Technol 268: 415-423.

6.Méndez-García, C., Peláez, A. I., Mesa, V., Sánchez, J., Golyshina, O. V. and Ferrer, M. (2015). Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats. Front Microbiol 6: 475.

7.Tao, J., Qin, C., Feng, X., Ma, L., Liu, X., Yin, H., Liang, Y., Liu, H., Huang, C., Zhang, Z., Xiao, N. and Meng, D. (2018). Traits of exogenous species and indigenous community contribute to the species colonization and community succession. Front Microbiol 9: 3087.

8.Wang, X., Ma, L., Wu, J., Xiao, Y., Tao, J. and Liu, X. (2020). Effective bioleaching of low-grade copper ores: Insights from microbial cross experiments. Bioresour Technol 308: 123273.

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