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作者：岳修楓，南京農(nóng)業(yè)大學碩士在讀，主要研究原噬菌體與土壤健康。 周刊主要展示優(yōu)秀周報，每周定期為您奉上學術盛宴！本期周刊為您介紹調(diào)控噬菌體免疫和宿主行為的噬菌體蛋白。原文于2024年發(fā)表在《Nature Microbiology》上。
為保證自身的成功繁殖，噬菌體已經(jīng)進化出多種策略來克服宿主防御系統(tǒng)并操縱細菌的生物合成。與此同時，細菌也進化出了大量抵抗噬菌體的元件，這些元件包括核酸酶、解旋酶、蛋白酶和激酶。其中，來自RM系統(tǒng)（限制性修飾）和CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸酶能切割噬菌體DNA，已被廣泛研究。然而，蛋白酶在噬菌體防御中的作用卻鮮有研究。本文作者從銅綠假單胞菌噬菌體PaoP5中鑒定出一種名為Dap1的噬菌體蛋白，該蛋白具有調(diào)節(jié)細菌宿主行為和防御Lon蛋白酶介導的新型噬菌體抵抗機制的雙重作用。此外，Dap1能夠提高噬菌體的生存優(yōu)勢、顯著提升噬菌體治療效率。在這篇文章中作者識別到噬菌體PaoP5中的蛋白Dap1并對該噬菌體蛋白進行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)Dap1能夠調(diào)節(jié)細菌的游動和生物膜的形成并設計了相關實驗，同時通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除PaoP5中的dap1基因來研究其對噬菌體適應性的影響，進一步評估Dap1的功能。與此同時作者發(fā)現(xiàn)Dap1在噬菌體逃避抗噬菌體免疫中起著重要的作用，并將Dap1運用到小鼠模型中評估其在噬菌體療法中的作用。通過一系列的實驗和分析，詳細闡述了噬菌體蛋白Dap1在調(diào)節(jié)細菌行為和逃避宿主免疫反應中的重要作用，并探討了其在噬菌體治療中的潛在應用。一、噬菌體蛋白Dap1抑制細菌運動 首先鑒定了裂解性噬菌體PaPo5中的基因，發(fā)現(xiàn)其具有相對廣泛的宿主范圍（圖1a）。細菌運動和生物膜是P. aeruginosa的重要毒力因素，因此作者首先探究了來自PaPo5中的60個假定orfs的生物活性并發(fā)現(xiàn)orf002、orf157、orf160、orf163、orf164、orf165或orf176在PAO1中的表達引發(fā)了顯著的生長缺陷（圖1b第一排），這表明這些基因產(chǎn)物對P. aeruginosa具有潛在毒性，而在這些基因產(chǎn)物之中，orf003（以下簡稱Dap1）過表達顯著抑制細菌游動和聚集（圖1b第二排）但不影響細菌生長，這表明Dap1的靶點應該是細菌活力蛋白。之后作者嘗試使用RNA測序來深入探究Dap1如何影響細菌運動。dap1的表達導致了166個基因在指數(shù)生長過程中的差異調(diào)控。其中，PAO1/ P -dap1菌株中52個基因表達上調(diào)，114個基因表達下調(diào)（變化倍數(shù)>2，P < 0.05，圖1c）。二、Dap1與DipA相互作用調(diào)控宿主行為RNA-seq數(shù)據(jù)顯示生物膜所需要的siaC和siaD在PAO1/p-dap1菌株中顯著上調(diào)，因此進一步探究Dap1是否影響銅綠假單胞菌生物膜的形成。根據(jù)COMSTAT分析顯示，與表達空載體的PAO1相比，PAO1/p-dap1菌株顯著增加了生物膜產(chǎn)量(圖1d)。這些數(shù)據(jù)表明Dap1能夠調(diào)節(jié)細菌的毒力，而細菌的運動和生物膜的形成是由第二信使信號分子環(huán)二gmp (c-di-GMP)30反向調(diào)節(jié)的，作者假設Dap1通過與二胍酸環(huán)化酶(DGC)或磷酸二酯酶(PDE)的結合來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)c-di-GMP水平，從而控制這兩種表型。為了驗證這一假設，作者使用細菌腺苷酸環(huán)化酶雙雜交(BACTH)試驗來檢測Dap1的潛在蛋白質(zhì)結合伴侶。與此同時作者發(fā)現(xiàn)DipA、RocR或ProE與Dap1聯(lián)合表達可導致高水平的β-半乳糖苷酶活性(圖1e)，并通過使用共免疫沉淀(CO-IP)實驗進一步驗證了相互作用，發(fā)現(xiàn)Dap1僅與DipA (PA5017)共洗脫(圖1f)，而不與RocR (PA3947)或ProE (PA5295)共洗脫，表明由Dap1表達引起的細菌行為改變是通過其與DipA的相互作用介導的。dipA的失活導致細胞c-di-GMP水平升高，抑制鞭毛運動轉(zhuǎn)換和游動。與PAO1中dap1的表達類似，與野生型親本菌株相比，ΔdipA突變體的生物膜形成增強，細菌游動和群體運動減弱(圖1c)?？紤]到Dap1與DipA相互作用，作者推斷在銅綠假單胞菌中Dap1的表達可能會改變胞內(nèi)c-di-GMP水平。為此，作者利用p-cdrA-lux報告基因融合檢測了PAO1/p-dap1和空載體PAO1中c-di-GMP的水平，并通過使用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)進一步驗證了結果(圖1g)。正如預期的那樣，dap1的表達沒有改變ΔdipA菌株胞內(nèi)c-di-GMP水平和細菌行為(圖1b)。作者構建了銅綠假單胞菌感染的小鼠模型來研究噬菌體Dap1蛋白在PAO1發(fā)病機制中的作用，生存研究表明，感染PAO1/ pUCP的小鼠在2天內(nèi)死亡80%，而感染PAO1/pUCP-dap1的小鼠在第5天的存活率為100%(圖1h)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明噬菌體蛋白Dap1的表達抑制了銅綠假單胞菌的致病性。 
圖1 噬菌體蛋白Dap1通過與c-di-GMP磷酸二酯酶相互作用調(diào)控銅綠假單胞毒力之后作者研究了Dap1在噬菌體適應性中的潛在作用。首先，作者使用RT-qPCR證實dap1是一個早期表達基因。緊接著使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)刪除PaoP5中的dap1基因，并以敲除orf014和orf153作為對照。作者發(fā)現(xiàn)PaoP5Δdap1形成了微小的噬菌斑，而PaoP5Δorf14和PaoP5Δorf153形成了類似野生型(WT)噬菌體的大斑塊(圖2a)。此外，PAO1中dap1的表達可以恢復PaoP5Δdap1的大斑塊，而PaoP5Δdap1在PAO1/p-dap1中的EOP與PAO1/ EV中的相似(圖2b)。這表明dap1對噬菌體適應性很重要。作者認為PaoP5Δdap1和WT噬菌體都能有效地與宿主結合(P > 0.05)，因此與宿主的結合并不是造成噬菌體差異的原因(圖2c)。而由于噬菌斑大小與裂解有關，所以作者評估了兩種噬菌體的裂解量大小。一步生長曲線實驗表明，PaoP5Δdap1產(chǎn)生的后代比PaoP5少(圖2d)。PaoP5和PaoP5Δdap1的裂解量大小分別為~104.95±17.14 pfu/細胞和14.52±3.62 pfu/細胞(圖2e)。因此，PaoP5Δdap1產(chǎn)生的后代數(shù)量僅為野生型噬菌體PaoP5產(chǎn)生后代數(shù)量的~13.83%。由于Dap1抑制DipA，因此作者推斷DipA可能限制PaoP5Δdap1的復制。然而，PaoP5Δdap1的小斑塊形成表型在感染ΔdipA時不能被挽救，這表明盡管Dap1抑制DipA，但Dap1賦予的噬菌體適應性與DipA無關。圖2 PaoP5Δdap1形成小噬菌斑，產(chǎn)生較少的后代由于dap1是一個促進噬菌體生產(chǎn)力的早期表達基因，作者假設PAO1中未知的噬菌體防御系統(tǒng)可能抑制噬菌體生產(chǎn)力，而dap1可以克服這種噬菌體防御系統(tǒng)。因此，作者使用蛋白質(zhì)組學方法來表征Dap1對噬菌體蛋白(圖3a)和宿主蛋白的影響。PaoP5Δdap1-infected PAO1中下調(diào)了兩種噬菌體蛋白(Orf049, Orf050)。Orf050在PaoP5Δdap1-infected
PAO1中的豐度降低到約為PaoP5感染PAO1蛋白水平的十分之一(圖3a)。Orf50為HNH內(nèi)切酶，它是噬菌體DNA包裝的重要組成部分。PaoP5Δdap1能夠形成大斑塊(圖3b)，這表明HNH水平的降低對PaoP5Δdap1包裝的減少有影響。而陰性染色的噬菌體裂解物的電子顯微鏡顯示，由于噬菌體PaoP5Δdap1裂解物缺乏DNA包裝，導致大量的噬菌體顆粒不含DNA，并且在PAO1中表達dap1或hnh完全恢復了DNA包裝效率至野生型噬菌體水平(圖3c,d)。這些數(shù)據(jù)表明，當PaoP5Δdap1感染PAO1時，噬菌體HNH內(nèi)切酶顯著降解，產(chǎn)生的后代也更少。
圖3 PaoP5Δdap1在基因組包裝中效率較低 五、Lon蛋白酶保護PAO1抵抗PaoP5Δdap1以上數(shù)據(jù)都表明Dap1可能保護HNH內(nèi)切酶免受快速降解。作者推斷銅綠假單胞菌的蛋白酶Lon可能參與了HNH內(nèi)切酶的降解。有研究表明Lon可切割大腸桿菌的原噬菌體蛋白。為了驗證這一假設，作者使用PaoP5Δdap1感染野生型PAO1或Δlon，而數(shù)據(jù)表明PaoP5Δdap1在Δlon中形成的斑塊比在PAO1中形成的斑塊更大(圖4a)。此外，電子顯微照片顯示，PaoP5Δdap1的大多數(shù)后代都被DNA包裹在Δlon中(圖4b,c)。然后，作者通過4D無標記高通量蛋白質(zhì)組學分析PaoP5Δdap1-infected
PAO1或Δlon，發(fā)現(xiàn)Lon對宿主蛋白有顯著影響，鑒定出697個宿主蛋白為差異表達蛋白。在噬菌體蛋白中，PaoP5Δdap1-infected
Δlon中的HNH內(nèi)切酶(Orf050)豐度明顯高于PaoP5Δdap1-infected PAO1(圖4D)，這說明沒有Lon，噬菌體HNH內(nèi)切酶無明顯降解。上述結果暗示了銅綠假單胞菌Lon蛋白酶可能作為宿主編碼噬菌體限制性蛋白的功能作用。作者發(fā)現(xiàn)Lon可以抑制銅綠假單胞菌噬菌體PaP_Se，因為在沒有Lon的情況下，噬菌體滴度增加了約100倍(圖4e)。然而，過表達dap1并不能提高PAO1中噬菌體PaP_Se的生產(chǎn)力，這表明Lon可能通過其他機制保護PAO1免受PaP_Se的侵害，而這些機制是噬菌體dap1無法克服的。總的來說，這些數(shù)據(jù)揭示了Lon蛋白酶作為噬菌體防御蛋白和抑制PaoP5Δdap1和環(huán)境分離噬菌體PAP_se的作用。 圖4 Lon蛋白酶降低了HNH內(nèi)切酶的豐度，抑制了PaoP5Δdap1噬菌體基因組的包裝六、Dap1與HNH結合，阻止長鏈介導的HNH降解由于Lon蛋白酶降低了HNH內(nèi)切酶的豐度，作者進行了體外實驗，發(fā)現(xiàn)在Lon蛋白酶和激酶存在的情況下HNH內(nèi)切酶被降解(圖5a)。通過細菌雙雜交(圖5b)和Co-IP分析(圖5c)均未發(fā)現(xiàn)Dap1和Lon之間的直接相互作用。由于Lon是一種重要的蛋白酶，如果Dap1直接與Lon結合并干擾其功能，作者預計過表達Dap1的PAO1會出現(xiàn)生長缺陷，但事實并非如此。因此，作者的數(shù)據(jù)表明Dap1不會與Lon結合以抑制其蛋白酶活性。隨后作者提出Dap1可能與HNH內(nèi)切酶結合以阻止長鏈介導的HNH降解。正如預期的那樣，BACTH(圖5b)和pull-down實驗(圖5d)都檢測到了Dap1與HNH的結合，體外蛋白降解實驗顯示Lon降解了Dap1。然而，當Dap1與HNH預混時，Dap1-HNH混合物的降解減少(圖5e)?？偟膩碚f，Dap1與HNH結合，保護其免受長鏈介導的降解。圖5 Dap1結合HNH內(nèi)切酶阻止長鏈介導的HNH降解為了進一步表征dap1對噬菌體適應性的影響，作者進行了競爭實驗，發(fā)現(xiàn)PaoP5和PaoP5Δdap1的相對豐度分別為94.67%±2.62%和3.33%±2.62%(圖6a)。此外，PaoP5Δdap1被另外兩種環(huán)境分離的噬菌體打敗(圖6a)?？傊?，這一結果表明PaoP5Δdap1在與感染同一宿主的其他噬菌體競爭時處于明顯的劣勢，這表明dap1對Paop5類噬菌體在自然環(huán)境中的生存至關重要。作者隨后利用小鼠模型進一步測試了Dap1對噬菌體治療的影響。單劑量的PaoP5噬菌體在感染復數(shù)(MOI)為10時，可抑制100%的銅綠假單胞菌腹腔感染小鼠(圖6b)。然而，當P. aeruginosa腹腔感染小鼠用單劑量噬菌體PaoP5Δdap1處理時，所有小鼠在7天內(nèi)死亡，盡管小鼠表現(xiàn)出延遲死亡時間(圖6b)。。為了評估噬菌體耐藥性是否是PaoP5Δdap1治療失敗的原因，從死亡小鼠中分離的200個菌落進行了噬菌體耐藥性評估?？傮w而言，這些菌株中41%是噬菌體敏感的銅綠假單胞菌，39%是耐噬菌體的銅綠假單胞菌，而其他耐噬菌體菌株是腸道共生菌，它們可能在全身性細菌共感染后轉(zhuǎn)移到肝臟。因此，在PaoP5Δdap1-treated小鼠中觀察到噬菌體抗性突變，這也可能是導致小鼠死亡的原因。這些數(shù)據(jù)表明，dap1對噬菌體治療的有效性至關重要，而自我復制以產(chǎn)生足夠的后代來快速感染和清除細菌是噬菌體治療成功的關鍵。接下來，作者檢索了NCBI的同源基因，調(diào)查了dap1和hnh基因在銅綠假單胞菌噬菌體中的流行程度。截至2023年10月，785個測序的假單胞菌噬菌體中，有50個攜帶dap1同源基因，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關系，48個同源性最低為90%的dap1樣噬菌體基因聚為3支(圖6c)。具體來說，dap1在pak_p1樣噬菌體中相對保守，對于hnh基因，BLAST預測了99個hnh內(nèi)切酶，與ORF050的同源性最低為30%，聚類為7個分支(圖6d)。這些生物信息學分析表明，dap1樣基因在銅綠假單胞菌噬菌體的一個亞群中是保守的。圖6 Dap1對噬菌體的適應性和噬菌體治療的有效性至關重要 該項研究深入揭示了噬菌體蛋白Dap1的雙重功能：它不僅能夠調(diào)控細菌的行為，而且還能幫助噬菌體逃避由細菌Lon蛋白酶所介導的噬菌體防御機制，顯著提升了噬菌體的適應性和生存能力。這些發(fā)現(xiàn)不僅為我們理解噬菌體如何通過進化策略來增強其在宿主環(huán)境中的適應性提供了新視角，也為噬菌體療法的開發(fā)和應用提供了潛在的新思路。 原名：Bacteriophage protein Dap1 regulates evasion of
antiphage immunity and Pseudomonas aeruginosa virulence impacting phage
therapy in mice譯名：噬菌體蛋白Dap1調(diào)節(jié)抗噬菌體免疫逃避和銅綠假單胞菌的毒力，影響小鼠中的噬菌體治療DOI：https:///10.1038/s41564-024-01719-5
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