Water Research: 寧波大學(xué)張化俊/張德民組揭示含氯消毒劑消毒海水后原核群落的恢復(fù)機(jī)制

宏基因組測序揭示消毒后海水原核群落恢復(fù)機(jī)制及對抗生素抗性基因傳播的影響

Metagenomic insights into the rapid recovery mechanisms of prokaryotic community and spread of antibiotic resistance genes after seawater disinfection

Article，2024-12-04

Water Research, [IF 11.4]

DOI：https:///10.1016/j.watres.2024.122887

原文鏈接：https://www./science/article/pii/S0043135424017871?via%3Dihub

第一作者：JiaoJiao Yan (閆嬌嬌)；Xinxu Zhang (張新旭)

通訊作者：Demin Zhang (張德民)；Huajun Zhang (張化俊)

合作作者：Xinyong Shi (史新勇)；Jialin Wu (吳家林)；Ziang Zhou (周子昂)；Yawen Tang (湯雅文)；Zhen Bao (鮑真)；Nan Luo (羅楠)；Jiong Chen (陳炯)

主要單位：

寧波大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)    

寧波大學(xué)東海戰(zhàn)略研究院 (Marine Economic Research Center, Donghai Academy, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)

深圳大學(xué)(Archaeal Biology Center, Synthetic Biology Research Center, Shenzhen Key Laboratory of Marine Microbiome Engineering, Key Laboratory of Marine Microbiome Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, Institute for Advanced Study, Shenzhen University, Shenzhen, 518060, China)

上海承葛生物技術(shù)有限公司(Shanghai Treatgut Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, 200441, China)

寧波大學(xué)海洋學(xué)院(Key Laboratory of Aquacultural Biotechnology, Ministry of Education, School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo, 315211, China)

寧波海微生態(tài)科技有限公司(Ningbo Haiwei Ecological Technology Co., Ltd., Ningbo, 315141, China)          

摘要

Abstract

含氯消毒劑，如漂白粉，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的源水消毒管控，以控制細(xì)菌等病原菌并消除抗生素抗性基因（ARGs）。然而，消毒后原核生物群落組成（PCCs）的快速恢復(fù)可能會顯著影響消毒的總體效果。目前，關(guān)于PCCs的快速恢復(fù)機(jī)制及其對海水中ARGs去除的影響尚未見報(bào)道。本研究針對水產(chǎn)養(yǎng)殖的消毒過程，利用16S rRNA基因擴(kuò)增子和宏基因組測序技術(shù)，對上述問題進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明，PCCs的恢復(fù)在消毒16 h后即開始，至72 h恢復(fù)至與對照類似組成。PCCs快速恢復(fù)的機(jī)制是消毒后微生物間的協(xié)同互作增強(qiáng)和消毒抗性細(xì)菌（DRB）的存在所致。與外排泵相關(guān)的消毒抗性基因（DRGs）是支持DRB抵抗消毒的主要分子機(jī)制。在78種注釋到的ARGs中，只有10種ARGs在消毒72 h后顯著下降（P < 0.05），表明漂白粉消毒對ARGs的去除效果有限。此外，基于宏基因組分箱的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對消毒劑和抗生素具有共抗性的現(xiàn)象。針對分箱得到的假單胞菌科的兩種高抗DRB的基因組分析表明，這兩種DRB均攜帶16種DRGs，有助于PCCs的恢復(fù)和ARGs的傳播。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了消毒后PCCs的快速恢復(fù)機(jī)制，并在海水細(xì)菌中觀察到了細(xì)菌對消毒劑和抗生素的共抗性現(xiàn)象，對海水中病原菌和ARGs的管理具有重要意義。    

引言

Introduction

水產(chǎn)養(yǎng)殖病害頻發(fā)，為養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，進(jìn)行海水消毒是控制潛在病原，確保養(yǎng)殖順利開展的必要措施。含氯消毒劑（如漂白粉）的消毒是水處理系統(tǒng)中常見的水質(zhì)安全管控措施，用以控制水中的病原菌和去除抗生素耐藥基因（antibiotic resistance genes, ARGs）等風(fēng)險(xiǎn)因子。在我們之前的研究中（Tang et al., Water Research, 2023），發(fā)現(xiàn)使用漂白粉消毒海水后雖然30 min內(nèi)漂白粉具有極強(qiáng)的殺滅作用，但消毒16 h后，細(xì)菌群落能夠迅速恢復(fù)；然而，導(dǎo)致微生物群落快速恢復(fù)的機(jī)制仍不清楚。本研究中，我們利用生產(chǎn)中常用漂白粉濃度100pm于對蝦帆布池系統(tǒng)中進(jìn)行海水消毒（圖1A），通過宏基因組測序，全面探討了消毒后細(xì)菌群落的共現(xiàn)模式及抗生素抗性基因（ARGs）、消毒抗性細(xì)菌（DRB）與消毒抗性基因（DRGs）之間的相互作用，揭示：（1）消毒后原核生物群落的恢復(fù)模式及DRB對群落恢復(fù)的作用；（2）微生物間相互作用對原核生物群落恢復(fù)的貢獻(xiàn)；（3）闡明DRGs、ARGs和DRB之間的關(guān)系，以及它們在原核生物群落恢復(fù)中的作用。本研究結(jié)果將為制定合理高效的海水消毒管控措施，解決消毒對ARGs傳播的影響等公共衛(wèi)生問題提供重要依據(jù)。

結(jié)果

Results

消毒后原核群落變化及恢復(fù)特征

Rapid recovery of prokaryotic community compositions

消毒后，原核群落組成在0.5 h內(nèi)迅速改變，并于16 h后開始恢復(fù)（圖1B）。對照組中，α-變形菌的平均相對豐度為34.07%；消毒0.5 h后，α-變形菌的相對豐度顯著降低，至16h時(shí)相對豐度為1.37%-7.24%；隨后開始恢復(fù)，在消毒后24 h-168 h的平均相對豐度為56.67%。γ-變形菌則呈現(xiàn)相反的趨勢，從消毒后0.5 h開始，相對豐度急劇上升，至16 h達(dá)到94.54%，隨后逐漸恢復(fù)，至72h時(shí)與CK組接近?？扑缴?，原核群落生消主要由Rhodobacteraceae的再生和Pseudoalteromonadaceae的衰退所主導(dǎo)。NMDS分析發(fā)現(xiàn)（圖1C，D），消毒后原核群落結(jié)構(gòu)差異顯著，且表現(xiàn)出顯著的恢復(fù)特征。    

圖1. 消毒后原核群落組成和結(jié)構(gòu)變化

A：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。紅色時(shí)間點(diǎn)為宏基因組測序樣品。B：原核群落組成變化。C-D：原核群落結(jié)構(gòu)（基于擴(kuò)增子測序）和功能結(jié)構(gòu)（基于宏基因組）變化。CK：對照組；DST：消毒組。

消毒后原核群落的互作關(guān)系

Co-occurrence patterns of prokaryotic community after disinfection

網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，CK組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)和邊的數(shù)量從16 h內(nèi)的98個(gè)（183條邊）增加到72 h的285個(gè)（984條邊）。與CK組相比，DST組在16 h內(nèi)的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)具有最大的節(jié)點(diǎn)數(shù)（556個(gè)）和邊數(shù)（2557條），是所有網(wǎng)絡(luò)中最復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，而且原核生物間的互作主要是正相關(guān)作用。然而， DST組的網(wǎng)絡(luò)在16 h-72 h的恢復(fù)過程中表現(xiàn)出簡化的趨勢，72 h后其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)與CK組網(wǎng)絡(luò)接近，表明消毒72 h后微生物間的互作恢復(fù)至與對照類似水平。綜上，消毒后但在群落恢復(fù)前（16 h內(nèi)），水體原核生物間互作增強(qiáng)且主要為正相互作用，說明原核生物可通過增加協(xié)同互作來共同抵抗消毒的高壓環(huán)境（類似“抱團(tuán)取暖”），當(dāng)余氯消解后環(huán)境壓力減弱，原核間的互作強(qiáng)度下降并恢復(fù)至對照水平。   

圖2. 原核生物間互作關(guān)系

A-B：CK組16 h內(nèi)（A）和24 h-72 h（B）的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。C-D：DST組16 h內(nèi)（C）和24 h-72 h（D）的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。E：各網(wǎng)絡(luò)物種的節(jié)點(diǎn)數(shù)。F-G：分別為CK組和DST組各物種比例。節(jié)點(diǎn)顏色按門水平著色；邊的紅色和綠色分別代表正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。CK：對照組；DST：消毒組。

原核生物宏基因組分箱結(jié)果

Overview of compositions and characteristics of MAGs

宏基因組分箱得到168個(gè)MAGs，包括166個(gè)細(xì)菌和2個(gè)古菌。細(xì)菌MAGs主要包括α-變形菌（45個(gè)MAGs）和γ-變形菌（40個(gè)MAGs）。在30個(gè)最高豐度的MAGs中，Bin73（Pseudomonas khazarica）在16 h內(nèi)的DST組中具有最高的豐度（平均相對豐度為5.60%），表明其對消毒具有較強(qiáng)的抗性（圖3）；Bin160（Pseudomaricurvus albida，2.48%）和Bin15（Stutzerimonas chloritidismutans，1.67%）在DST組的16 h也有較高的豐度。在72 h時(shí)，Bin21（UBA1280，15.85%）、Bin143（Kordiimonas，9.04%）和Bin110（Leisingera，2.59%）是DST組中主要的MAGs。    

圖3. 166個(gè)細(xì)菌MAGs的系統(tǒng)發(fā)育分析

30個(gè)豐度最高的MAGs用黑點(diǎn)標(biāo)記；> 90%的Bootstrap值以淺藍(lán)色顯示

消毒對環(huán)境中ARGs和DRGs的影響

Impacts of disinfection on the relative abundances of ARGs, DRGs and their hosts

經(jīng)與CARD數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定到78個(gè)ARGs（圖4）。消毒后72 h，只有10個(gè)ARGs的豐度顯著下降（P < 0.05）；另有7個(gè)ARGs在消毒后豐度顯著升高（圖4A，B）。與細(xì)菌密切相關(guān)的ARGs主要是氟喹諾酮類和鏈霉素類，主要與α-變形菌、γ-變形菌相關(guān)。結(jié)果表明，漂白粉消毒無法有效去除海水環(huán)境中的ARGs。在56個(gè)注釋的DRGs中，消毒72 h后，有37個(gè)DRGs在CK和DST中的豐度差異顯著，主要屬于外排泵系統(tǒng)（15個(gè)基因）、細(xì)胞膜通透性（7個(gè)基因）和氧化應(yīng)激（7個(gè)基因）。消毒后72 h，與外排泵系統(tǒng)相關(guān)的15個(gè)基因中有9個(gè)被顯著富集，表明它們在DRB抗消毒中起關(guān)鍵作用。與細(xì)胞膜通透性和氧化應(yīng)激系統(tǒng)相關(guān)的基因中分別有 5個(gè)（5/7）和3個(gè)（3/7）被顯著富集。DRGs與紅桿菌科的Zongyanglinia有最多的共現(xiàn)關(guān)系，其次是弧菌和假交替單胞菌。    

圖4. ARGs和DRGs對消毒的響應(yīng)

A: 消毒后72 h顯著變化的ARGs（上）和DRGs（下）。B：ARGs（上）和DRGs（下）與微生物的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。C：ARGs（左）和DRGs（右）在網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)數(shù)量

消毒后環(huán)境中DRGs、ARGs和細(xì)菌三者間的關(guān)系

Relationships between DRGs and ARGs

在相對豐度最高的30個(gè)MAGs中富集的DRGs主要與外排泵、EPS和氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)（圖5）。在紅桿菌科、交替單胞菌科、Kordiimonadaceae和假單胞菌科的細(xì)菌中，DRGs的豐度，特別是acrR、tolC、coxB、gspG、hemN和msrA基因的豐度較高（圖5A）。另外，在Bin73（P. khazarica）中，外排泵系統(tǒng)中的acrR、oprM和tolC基因顯著富集，這些基因的高豐度或保證了該菌的高消毒抗性?；赟pearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，消毒后72 h 的ARGs與具有顯著差異的DRGs之間有顯著的相關(guān)性，包括5個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類、6個(gè)氟喹諾酮類、5個(gè)β-內(nèi)酰胺類和3個(gè)二氨基嘧啶類ARGs，在消毒后與幾乎所有類型的DRGs都表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性；這些DRGs主要屬于細(xì)胞膜通透性、外排泵系統(tǒng)和胞外聚合物分泌系統(tǒng)相關(guān)基因（圖5B）。?；鶊D分析發(fā)現(xiàn)，源自6個(gè)細(xì)菌科的DRGs促進(jìn)了ARGs在消毒后的傳播，包括紅桿菌科（11.66%）、玫瑰桿菌科（9.58%）、交替單胞菌科（3.75%）、海洋螺菌科（2.82%）、纖維弧菌科（2.66%）和染色菌科（2.44%）（圖5C）。    

圖5. 細(xì)菌、ARGs和DRGs三者間的關(guān)系

A：豐度最高的30個(gè)MAGs中的DRGs。B：ARGs和DRGs間的Spearman相關(guān)性。C：Sankey分析消毒后細(xì)菌通過何種DRGs促進(jìn)主要ARGs的傳播。    

高抗消毒細(xì)菌的抗消毒機(jī)制

Resistance mechanisms of bacteria to disinfection

在消毒后16 h內(nèi)，Bin73（P. khazarica）和Bin15（S. chloritidismutans）的相對豐度顯著增加（圖3）；由于此時(shí)處于高氯環(huán)境，因此我們認(rèn)為這兩株菌是高抗消毒細(xì)菌。宏基因組分箱獲得了兩株菌的高質(zhì)量基因組（完整度高于90%且污染度低于3%）。兩個(gè)MAGs都屬于假單胞菌科，Bin73中含有16個(gè)DRGs，主要屬于EPS分泌系統(tǒng)（5個(gè)）、細(xì)胞膜通透性（4個(gè)）、外排泵系統(tǒng)（4個(gè)）以及氧化應(yīng)激（3個(gè)）系統(tǒng)（圖6A）。此外，在Bin73基因組中還比對到2個(gè)ARGs，且都與與DRGs在基因位置上緊密相鄰。Bin15同樣有16個(gè)DRGs，分別屬于氧化應(yīng)激（5個(gè)）、EPS分泌系統(tǒng)（5個(gè)）、外排泵系統(tǒng)（3個(gè)）和細(xì)胞膜通透性（3個(gè)）系統(tǒng)（圖6B）。Bin15基因組中含有1個(gè)ARGs。以上結(jié)果表明，高抗菌株基因組上大量的DRGs為細(xì)菌在高氯環(huán)境下存活提供了強(qiáng)大的抗性；而且高抗菌株還同時(shí)攜帶ARGs，表明其對消毒劑和抗生素具有共抗性。通過AntiSMASH次級代謝產(chǎn)物預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)菌中存在13種次級代謝產(chǎn)物合成基因簇（圖6C），具有較強(qiáng)的改善環(huán)境的能力。    

圖6. 兩個(gè)高抗消毒細(xì)菌的比較基因組及代謝潛力

A：Bin73與Pseudomonas khazarica ODT-83a。B：Bin15與Stutzerimonas chloritidismutans 6L11。紅色圈代表菌株的MAGs，藍(lán)色圈代表參考基因組

C：AntiSMASH預(yù)測的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇。

討論

Discussion

與我們之前的研究（Tang et al., Water Research, 2023）相比，本次研究開展于夏季且地點(diǎn)不同，即兩次實(shí)驗(yàn)的環(huán)境溫度和起始細(xì)菌群落不同。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論溫度或起始細(xì)菌群落是否一致，海水經(jīng)消毒后原核群落均能迅速恢復(fù)，這是一種普遍現(xiàn)象。傳統(tǒng)上，消毒后DRB的存在被認(rèn)為有助于群落的恢復(fù)；然而，本研究發(fā)現(xiàn)消毒后微生物之間的協(xié)同互作在促進(jìn)原核群落的快速恢復(fù)中也具有至關(guān)重要的作用。此外，漂白粉消毒并未有效去海水中的ARGs，因?yàn)楹Ｋ?xì)菌對消毒劑和抗生素具有共抗性，消毒后有助于ARGs在水中的存留，這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了我們對海水中多重耐藥機(jī)制的認(rèn)知。兩種高抗消毒的DRB基因組攜帶了多個(gè)DRGs和ARGs，使其能夠在消毒環(huán)境中生存，并可能促進(jìn)ARGs的傳播。因此，當(dāng)前在海水養(yǎng)殖中使用的消毒策略可能通過促進(jìn)細(xì)菌對各種消毒劑的共抗性，帶來環(huán)境和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。未來，采用與氯基消毒劑機(jī)制不同的二次消毒方法，如紫外線或臭氧處理，可能有效緩解這些潛在風(fēng)險(xiǎn)。    

參考文獻(xiàn)

Jiaojiao Yan^#, Xinxu Zhang^#, Xinyong Shi, Jialin Wu, Ziang Zhou, Yawen Tang, Zhen Bao, Nan Luo, Demin Zhang*, Jiong Chen, Huajun Zhang*. Metagenomic insights into the rapid recovery mechanisms of prokaryotic community and spread of antibiotic resistance genes after seawater disinfection. Water Research, 2025, 271: 122887

第一作者簡介

閆嬌嬌，寧波大學(xué)海洋學(xué)院2021級碩士生，研究方向?yàn)樗w微生物生態(tài)。現(xiàn)為上海承葛醫(yī)藥科技有限公司生信工程師，負(fù)責(zé)微生物組分析新方法流程搭建及基于微生態(tài)NGS大數(shù)據(jù)挖掘活菌藥物靶點(diǎn)菌株相關(guān)研究。    

張新旭，深圳大學(xué)高等研究院，研究員，博士生導(dǎo)師。博士畢業(yè)于上海交通大學(xué)，主要從事水產(chǎn)微生物生態(tài)與深部生物圈方面的研究工作，先后主持4項(xiàng)國家級、1項(xiàng)省級和2項(xiàng)市級科研項(xiàng)目，包括1項(xiàng)國家基金委重大研究計(jì)劃培育項(xiàng)目、面上項(xiàng)目和青年基金項(xiàng)目。近年來，在海洋無脊椎動物的血淋巴菌群、免疫與健康養(yǎng)殖等方面做了大量工作，以第一或通訊作者發(fā)表論文16篇（包括Trends in Microbiology、Science China Life Sciences、Molecular Biology and Evolution、Water Research、Applied and Environmental Microbiology、Developmental and Comparative Immunology、mSystems等），已授權(quán)國家發(fā)明專利4項(xiàng)。獲得2023年“簡浩然環(huán)境微生物基金”優(yōu)秀論文獎(jiǎng)（排名第1），2021年深圳市優(yōu)秀自然科學(xué)學(xué)術(shù)論文獎(jiǎng)（排名第6）。團(tuán)隊(duì)聘博士后2人，感興趣的請聯(lián)系：2310394018@email.szu.edu.cn。

通訊作者簡介　　

張德民，寧波大學(xué)海洋學(xué)院教授。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“微生物與水域生態(tài)健康”團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人。中國生態(tài)學(xué)會微生物生態(tài)專委會顧問主任，中國水產(chǎn)微生物生態(tài)與資源專委會副主任。主持完成國家863項(xiàng)目1項(xiàng)，國家自然科學(xué)基2項(xiàng)，浙江省杰青項(xiàng)目1項(xiàng)。國際上率先應(yīng)用微生物組學(xué)研究養(yǎng)殖環(huán)境—微生物群落—對蝦健康三者之間的動態(tài)互作關(guān)系，系統(tǒng)揭示了微生物群落穩(wěn)態(tài)在對蝦養(yǎng)殖健康中的核心作用，提出基于微生態(tài)視角的對蝦健康養(yǎng)殖新理念新路徑。在Microbiome、Water Research、 npj Biofilms and Microbiome、Molecular Ecology、Aquaculture等微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和水產(chǎn)學(xué)權(quán)專業(yè)期刊發(fā)表論文90余篇，授權(quán)專利6項(xiàng)。

張化俊，寧波大學(xué)海洋學(xué)院，副教授，博士生導(dǎo)師。2015年畢業(yè)于廈門大學(xué)，獲博士學(xué)位；于2019年6月赴美國加州大學(xué)圣地亞哥分校Scripps海洋研究開展為期1年的訪學(xué)交流。長期從事強(qiáng)烈環(huán)境擾動下（如海水增溫、余氯）海洋微生物生態(tài)系統(tǒng)的響應(yīng)特征及機(jī)制研究。主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目2項(xiàng)，浙江省自然基金2項(xiàng)，廳市級項(xiàng)目5項(xiàng)，橫向項(xiàng)目3項(xiàng)；做為骨干成員參與NSFC區(qū)域創(chuàng)新發(fā)展聯(lián)合基金（寧波）重點(diǎn)項(xiàng)目1項(xiàng)。在Water Research、 Environmental Microbiology、Science of the Total Environment、Applied and Environmental Microbiology、mSphere（2024當(dāng)期封面論文）、Microbial Ecology等刊物發(fā)表論文40余篇。Frontiers in Microbiology 雜志Associate Editor。