晝夜節(jié)律紊亂被視為癌癥預(yù)后不良的一個(gè)標(biāo)志，然而睡眠不足（SD）促進(jìn)腫瘤發(fā)生的生理過程仍不明確；已有研究表明脂肪酸氧化（FAO）失調(diào)可增強(qiáng)腫瘤惡性特征，特別是作為FAO的限速酶，ACSL 1在癌癥中高表達(dá)，但其節(jié)律性破壞的作用未知；已知β-內(nèi)啡肽，一種內(nèi)源性具有類似嗎啡作用肽類物質(zhì)，其晝夜振蕩與生物鐘穩(wěn)態(tài)相關(guān)，具有抑制癌癥的潛能，但不同的給藥節(jié)律是否能減輕腫瘤尚待研究。

FAO：脂肪酸氧化；SD：睡眠不足/睡眠剝奪；ACSL1：?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員1；PA：棕櫚酸；PA-CoA：棕櫚酰肉堿輔酶A；CLOCK：晝夜節(jié)律穩(wěn)態(tài)核心基因

為了探究睡眠剝奪（SD）對(duì)小鼠肺部生理節(jié)律的影響，對(duì)SD處理后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠肺組織進(jìn)行組學(xué)檢測(cè)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出3284個(gè)在SD后喪失晝夜振蕩的基因，GO富集分析顯示這些基因在脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物過程中富集，尤其是脂肪酸氧化（FAO）。隨后的UHPLC-MS代謝組學(xué)進(jìn)一步證實(shí)，SD處理使得小鼠肺組織中晝夜振蕩的脂質(zhì)代謝物數(shù)量顯著減少， 47種脂質(zhì)物質(zhì)發(fā)生節(jié)律紊亂，其中游離脂肪酸占比最大。

以上結(jié)果表明，在基因表達(dá)和代謝功能層面，F(xiàn)AO均能夠感知生理?xiàng)l件下SD誘導(dǎo)的節(jié)律紊亂。

圖1. FAO可感知SD處理導(dǎo)致的晝夜節(jié)律紊亂

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討SD誘導(dǎo)的FAO節(jié)律紊亂是否在肺癌發(fā)展中發(fā)揮作用，為此構(gòu)建了肺癌小鼠模型并實(shí)施SD處理，通過CT圖像、HE染色和IHC等結(jié)果確認(rèn)了肺癌形成和干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。

為明確SD促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制，對(duì)小鼠肺癌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示SD顯著上調(diào)了與FAO相關(guān)的基因表達(dá)。此外，脂質(zhì)代謝組檢測(cè)也表明，SD處理后脂肪酰肉堿增加，游離脂肪酸減少，且脂肪酸氧化的最終產(chǎn)物乙酰輔酶A和腺苷三磷酸在肺癌中增加，并在SD條件下表現(xiàn)出節(jié)律紊亂。此外，向SD小鼠給予脂肪酸氧化抑制劑：依托莫司他（ETO），可逆轉(zhuǎn)肺癌進(jìn)展及干細(xì)胞特性的增強(qiáng)。

以上結(jié)果表明，F(xiàn)AO感知晝夜節(jié)律紊亂是睡眠剝奪增強(qiáng)肺癌干細(xì)胞特性的基礎(chǔ)。

圖2. FAO節(jié)律紊亂增強(qiáng)SD誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞干性

接下來尋找SD誘導(dǎo)FAO節(jié)律紊亂從而促進(jìn)肺癌干細(xì)胞特性的關(guān)鍵分子。首先從轉(zhuǎn)錄組結(jié)果里篩選出13個(gè)同時(shí)響應(yīng)節(jié)律紊亂和腫瘤進(jìn)展的FAO基因，其中ACSL1在mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)。在小鼠體內(nèi)特異性敲除該基因可逆轉(zhuǎn)SD促進(jìn)的腫瘤進(jìn)展，下調(diào)腫瘤組織中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。

隨后從脂質(zhì)組檢測(cè)結(jié)果里篩選可能作為ACSL1底物和產(chǎn)物的長(zhǎng)鏈FAO代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)SD可降低腫瘤組織中的棕櫚酸（PA）水平。敲低ACSL1可恢復(fù)SD誘導(dǎo)的PA下降，而補(bǔ)充棕櫚酰肉堿輔酶A（PA-CoA）——PA進(jìn)入FAO的活化態(tài)，可挽救ACSL1缺失下被抑制的癌癥干細(xì)胞特性和腫瘤生長(zhǎng)。

以上結(jié)果表明，SD擾亂ACSL1的節(jié)律，過度激活了它將PA轉(zhuǎn)化為PA-CoA的能力，從而促進(jìn)FAO，最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)。

圖3. ACSL1合成的PA-CoA有助于SD誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞干性

在分子機(jī)制方面，首先在不同的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)有兩種核心生物鐘基因：CLOCK和BMAL1，與ACSL1的表達(dá)量正相關(guān)。隨后在腫瘤模型中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)SD僅破壞CLOCK基因的節(jié)律振蕩，而對(duì)BMAL1無顯著影響。此外，通過分析表觀組學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)CLOCK和BMAL1在多種細(xì)胞中均占據(jù)了ACSL1的啟動(dòng)子區(qū)域，并且通過CHIP-qPCR和熒光素酶報(bào)告基因分析確認(rèn)了結(jié)合位點(diǎn)。作為驗(yàn)證，分別在鼠源和人源兩種腫瘤模型中敲除CLOCK基因，均觀察到了腫瘤生長(zhǎng)和干細(xì)胞特性被抑制的現(xiàn)象。

以上結(jié)果表明，核心生物鐘基因CLOCK可能通過直接結(jié)合到ACSL1啟動(dòng)子上的特定區(qū)域來調(diào)控該基因的表達(dá)。

圖4. ACSL1可感知SD誘導(dǎo)的FAO節(jié)律失常，促進(jìn)肺癌發(fā)生

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲低ACSL1會(huì)反過來降低CLOCK的蛋白水平，但不影響其mRNA水平，說明ACSL1可通過某些機(jī)制維持CLOCK的蛋白穩(wěn)定性；同時(shí)考慮到ACSL1催化的PA-CoA可以做為蛋白質(zhì)棕櫚?；牡孜?，因此研究者探討了棕櫚?；揎椩贏CSL1和CLOCK互作中的作用。

首先利用?；?生物素交換（ABE）和免疫印記等技術(shù)手段，證實(shí)了CLOCK蛋白上確實(shí)存在棕櫚酰化修飾。然后使用siRNA篩選出了23種可能的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，通過敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)確定了其中的ZDHHC5可介導(dǎo)CLOCK的棕櫚?；?。此外，還發(fā)現(xiàn)SD 處理一方面以ACSL1依賴的方式增強(qiáng)了CLOCK的棕櫚?；揎?，另一方面也破壞了這一修飾的晝夜節(jié)律性。隨后，通過在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站swisspalm鑒定了CLOCK的棕櫚?；稽c(diǎn)：Cys194，該位點(diǎn)在多物種中保守。進(jìn)一步地，CLOCK蛋白的降解和泛素化實(shí)驗(yàn)表明，棕櫚?；ㄟ^抑制泛素化依賴的蛋白酶體降解來穩(wěn)定CLOCK蛋白。

以上結(jié)果表明，ACSL1通過ZDHHC5使得CLOCK在Cys194上發(fā)生棕櫚?；揎棧@一修飾可阻止CLOCK因泛素化而降解，從而維持該蛋白的穩(wěn)定性。

圖5. ACSL 1通過ZDHHC 5對(duì)CLOCK進(jìn)行棕櫚酰化修飾，以此穩(wěn)定CLOCK蛋白

基于上述SD對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，研究者考慮基于晝夜節(jié)律的內(nèi)分泌治療方案。對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞系分別添加14種睡眠相關(guān)激素，發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)啡肽（Endor）可顯著下調(diào)CLOCK和ACSL1的mRNA表達(dá)水平，因此后續(xù)對(duì)β-內(nèi)啡肽展開節(jié)律治療應(yīng)用的研究。

對(duì)于SD條件下的荷瘤小鼠，研究人員設(shè)計(jì)了3種β-內(nèi)啡肽給藥方案：每日16:00給藥（ZT8-Endor）、每日4:00給藥（ZT20-Endor）以及持續(xù)給藥（pump-Endor）。從表型來看，ZT8-Endor方案顯著逆轉(zhuǎn)了SD導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)，而另外兩種方案效果不顯著。接下來使用ELISA評(píng)估了血清β-內(nèi)啡肽水平，發(fā)現(xiàn)SD處理破壞了β-內(nèi)啡肽的晝夜節(jié)律并使其保持在較低水平， 另外三種給藥處理雖都能提高β-內(nèi)啡肽含量，但僅ZT8-Endor能使其晝夜節(jié)律也恢復(fù)正常。同樣地，在ACSL1和CLOCK含量和腫瘤干性標(biāo)志物等指標(biāo)上也存在類似的規(guī)律。

圖6. β-內(nèi)啡肽可恢復(fù)受到SD干擾的CLOCK/ACSL1節(jié)律

最后為評(píng)估以上研究的臨床轉(zhuǎn)化潛力，進(jìn)行了人群隊(duì)列的前瞻性和回顧性研究。肺癌患者的前瞻性隊(duì)列數(shù)據(jù)表明，血清β-內(nèi)啡肽濃度與睡眠質(zhì)量正相關(guān)，且是癌癥發(fā)展的潛在預(yù)測(cè)因素；既往肺癌病例的回顧性分析結(jié)果表明，血清β-內(nèi)啡肽與較好的預(yù)后和生存率有關(guān)，而與CD166和Ki-67（兩種腫瘤標(biāo)志物）的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。

總而言之，這兩組隊(duì)列數(shù)據(jù)提供了SD、β-內(nèi)啡肽、CLOCK和ACSL1可能是肺癌獨(dú)立預(yù)后因素的臨床證據(jù)。

圖7. 肺癌患者的睡眠質(zhì)量和β-內(nèi)啡肽水平與CLOCK/ACSL1表達(dá)及預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)

本研究揭示了睡眠不足（SD）與肺癌發(fā)生發(fā)展之間的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了SD可導(dǎo)致脂肪酸氧化（FAO）紊亂，進(jìn)而促進(jìn)肺癌干細(xì)胞的形成和腫瘤生長(zhǎng)。在這一過程中，ACSL1基因與CLOCK基因之間的正反饋循環(huán)起到了關(guān)鍵作用。在治療階段，通過定時(shí)給予β-內(nèi)啡肽，可以有效逆轉(zhuǎn)SD引起的晝夜節(jié)律紊亂和FAO紊亂，從而減輕腫瘤的生長(zhǎng)。此外，研究證實(shí)睡眠質(zhì)量和血清β-內(nèi)啡肽水平與肺癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)AO作為一種晝夜節(jié)律感知機(jī)制，在連接睡眠不足與肺腫瘤進(jìn)展方面具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

Peng F, Lu J, Su K, et al. Oncogenic fatty acid oxidation senses circadian disruption in sleep-deficiency-enhanced tumorigenesis. Cell Metab. 2024.