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J. Exp. Bot. | 教你如何正確設(shè)計(jì)植物科學(xué)類(lèi)試驗(yàn)

 TONYv8y531fqpp 2024-11-07
為提高對(duì)植物科學(xué)領(lǐng)域的研究,研究者通常需要對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行操縱。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康牟煌O(shè)計(jì)的試驗(yàn)規(guī)模之間存在著很大的差異,包括:人工氣候室、一般溫室、微型氣候室和開(kāi)放式的田間試驗(yàn)。環(huán)境控制的應(yīng)用可能受到可用資源、操作成本和時(shí)間的限制。同時(shí),由于個(gè)體差異等因素的存在,同一處理中不同受試對(duì)象所產(chǎn)生的結(jié)果不盡相同,其具體指標(biāo)的取值必然有高低之分,這通常需要進(jìn)行大量的重復(fù)試驗(yàn)以代表該處理的真實(shí)效應(yīng)。因此,在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí),平衡大量試驗(yàn)安排上的挑戰(zhàn)和解決科學(xué)問(wèn)題是研究人員的共同愿望。
然而,偽重復(fù)pseudoreplication仍然是植物科學(xué)研究中的一個(gè)非常突出的問(wèn)題。

什么是偽重復(fù),為什么它是有問(wèn)題的?

偽重復(fù)是研究者將來(lái)自不同處理的獨(dú)立樣本集合進(jìn)行比較,而實(shí)際上這些樣本并不獨(dú)立,因?yàn)樗鼈儊?lái)自同一試驗(yàn)單元(同一重復(fù)內(nèi))。偽重復(fù)是一個(gè)很重要的問(wèn)題,因?yàn)椋?/span>(i)僅影響一種處理的隨機(jī)效應(yīng)或事件可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論;(ii)將亞單位作為獨(dú)立的試驗(yàn)單位,人為地夸大了數(shù)值差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。

辨別試驗(yàn)單元(experiment unit

試驗(yàn)單元是處理應(yīng)用的單元。正確識(shí)別試驗(yàn)單元是至關(guān)重要的,但并不總是直觀的。

圖片

Box 1中的一些關(guān)鍵定義

試驗(yàn)單元

試驗(yàn)處理應(yīng)用到的單元

試驗(yàn)亞單元

包含在試驗(yàn)單元中不獨(dú)立受試驗(yàn)處理的亞單元

自由度

用于評(píng)估參數(shù)估計(jì)值的獨(dú)立信息塊的數(shù)量

第一類(lèi)誤差

錯(cuò)誤地識(shí)別出不同處理之間的差異,而實(shí)際差異并不存在

第二類(lèi)誤差

未能發(fā)現(xiàn)處理之間的差異,而實(shí)際上有差異

統(tǒng)計(jì)功效

當(dāng)無(wú)效假設(shè)為假時(shí),統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)?zāi)苷_地拒絕它的概率

n

已獨(dú)立應(yīng)用該處理方法的試驗(yàn)單位數(shù)

    試驗(yàn)單元的性質(zhì)可以隨規(guī)?;蛟囼?yàn)設(shè)計(jì)而改變。為了說(shuō)明這一點(diǎn),作者提供了三個(gè)例子,其中試驗(yàn)單元分別是田間地塊 (1A),生長(zhǎng)室 (1B),單株植物(1C)。一些相關(guān)的術(shù)語(yǔ),如replicaterepeats,technical replicate,biological replicate, semi-biological replicate, treatment replicate,包括sample這些詞匯經(jīng)常被用來(lái)描述試驗(yàn)設(shè)計(jì),但其含義不明確。例如,在圖1B中,生物重復(fù)是一個(gè)亞單位,而在圖1C中,它是一個(gè)試驗(yàn)單位。處理效果的統(tǒng)計(jì)評(píng)估,以及與處理相關(guān)的誤差棒的呈現(xiàn),應(yīng)該在試驗(yàn)單位的水平上進(jìn)行。

圖片


圖1試驗(yàn)設(shè)計(jì)。(A) 試驗(yàn)地包括15個(gè)小區(qū);每小區(qū)(5m*15m包含160株個(gè)體植物。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理(1=白色,2=黑色,3=灰色),每個(gè)處理均有5個(gè)重復(fù)(即5個(gè)試驗(yàn)單元)。在這個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,單個(gè)處理有獨(dú)立重復(fù),但這些處理在整個(gè)研究中沒(méi)有相互分散;例如,與1處理相關(guān)的所有5個(gè)試驗(yàn)單元均位于試驗(yàn)區(qū)北端。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)屬于單因素3水平處理,每個(gè)處理有5個(gè)獨(dú)立重復(fù)的試驗(yàn)單元,每個(gè)試驗(yàn)單元有160個(gè)亞單元(植株)。(B)試驗(yàn)包括3個(gè)生長(zhǎng)室(人工氣候室),每個(gè)生長(zhǎng)室有10株植物,用來(lái)研究CO2濃度升高對(duì)植株生長(zhǎng)的影響。每個(gè)生長(zhǎng)室設(shè)置相同的光照、蒸汽壓差和溫度等生長(zhǎng)條件,將盆栽種子隨機(jī)分配到1、2或3室,所有植物都使用相同的方案進(jìn)行管理。CO2處理分別是室1(400 μmol mol-1)、室2(800 μmol mol-1)和室3(1200 μmol mol-1)。在這個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中有3個(gè)水平處理,每個(gè)處理有1個(gè)試驗(yàn)單元(即1個(gè)室),每個(gè)試驗(yàn)單元有10亞單元 (植株)。單處理無(wú)獨(dú)立重復(fù)和相互分散。(C)溫室實(shí)驗(yàn),研究不同微量元素(3個(gè)梯度)的影響,分別用黑色、深灰色和淺灰色花盆表示。研究人員在溫室內(nèi)隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本試驗(yàn)屬于單因素3水平處理,每個(gè)處理有8個(gè)獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)單元(植株),沒(méi)有亞單元。注意,在這種設(shè)計(jì)中仍然存在相互依賴的偽重復(fù)風(fēng)險(xiǎn),因?yàn)楸M管8個(gè)重復(fù)是隨機(jī)分布的,但它們可能共用同一營(yíng)養(yǎng)液。

 隨機(jī)效應(yīng)或事件

簡(jiǎn)單說(shuō),一個(gè)好的試驗(yàn)有兩個(gè)基本的統(tǒng)計(jì)要求,重復(fù)隨機(jī)化,或者更準(zhǔn)確地說(shuō),相互分散(interspersion)。除了操作造成誤差,使用未重復(fù)處理的假設(shè)有效性取決于試驗(yàn)單元在操作時(shí)是相同的,并且在整個(gè)試驗(yàn)期間保持相同。滿足這些標(biāo)準(zhǔn)是必要的,以確保在不可重復(fù)的試驗(yàn)效果歸因于操作,而不是試驗(yàn)單元之間的隨機(jī)變化。因此,如果n=1且試驗(yàn)結(jié)果與隨機(jī)效應(yīng)難以區(qū)分,那么這種驗(yàn)證實(shí)際上是不可能的。試驗(yàn)單元的重復(fù),以及試驗(yàn)單元在空間中的分散,提供了最好的保障,以防止歸因于處理或操作的偶然假現(xiàn)象。

考慮田間試驗(yàn)(1A),有重復(fù)(n=5) 但沒(méi)有分散的試驗(yàn)單元。在這個(gè)例子中,所有1處理小區(qū)都位于試驗(yàn)田北端,所有23處理的地塊都位于土地的中部或南端。這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)的問(wèn)題是,土地利用歷史或土地南北端之間的未知差異可能導(dǎo)致假試驗(yàn)現(xiàn)象。即使田間沒(méi)有預(yù)先存在的變化,試驗(yàn)期間發(fā)生的事件也可能不均勻地影響處理。例如,從北面鄰近農(nóng)田過(guò)度噴灑灌溉或殺蟲(chóng)劑對(duì)處理1試驗(yàn)區(qū)的影響要比處理23所用試驗(yàn)區(qū)大得多。這個(gè)假設(shè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的問(wèn)題已經(jīng)被很好地認(rèn)識(shí)到,并且很容易通過(guò)替代設(shè)計(jì)來(lái)緩解,例如隨機(jī)地塊。幸運(yùn)的是,圖1A所示的試驗(yàn)設(shè)計(jì)在試驗(yàn)中很少遇到。然而,當(dāng)植物生長(zhǎng)在受控環(huán)境中,試驗(yàn)安排限制(logistics constrains開(kāi)始對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)產(chǎn)生影響時(shí),這種簡(jiǎn)單隔離的極端形式經(jīng)常出現(xiàn)。

考慮人共氣候室試驗(yàn)(1B),使用設(shè)置在3個(gè)不同CO2水平下的植物生長(zhǎng)室,研究CO2濃度升高的影響。1B中描述的實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)在植物科學(xué)中很常見(jiàn)。在這個(gè)例子中,除了CO2處理外,研究人員設(shè)置了相同的室內(nèi)環(huán)境條件,但由于無(wú)法控制或無(wú)法測(cè)量的影響而產(chǎn)生的潛在假現(xiàn)象仍然存在。與研究領(lǐng)域的例子(1A)類(lèi)似,偽現(xiàn)象可表現(xiàn)為各氣候室間存在的差異;例如,試驗(yàn)前,1室被某名研究人員用于植物病原體實(shí)驗(yàn),使用后沒(méi)有進(jìn)行適當(dāng)?shù)那鍧崳?/span>2室的進(jìn)氣口毗鄰一個(gè)產(chǎn)生臭氧的設(shè)備,或者研究人員在3號(hào)室中安裝了不同的燈泡,它們的光譜質(zhì)量與1室或2室中的燈泡不同。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)差異,比如由于燈泡失靈導(dǎo)致1室的光照強(qiáng)度降低,或者2室的CO2罐被乙烯污染。由于某一特定處理的所有植物都位于一個(gè)氣候室中,其所特有的預(yù)先存在或突發(fā)效應(yīng)均會(huì)影響到該氣候室所有植株;隔離和隔離處理加劇了簡(jiǎn)單隔離的危險(xiǎn)。此外,單個(gè)氣候室的隔離增加了第一類(lèi)錯(cuò)誤 (見(jiàn)Box 1,即錯(cuò)誤地識(shí)別出不同處理之間的差異,而實(shí)際差異并不存在,人為制造誤差)的風(fēng)險(xiǎn),因?yàn)楦綦x促進(jìn)了氣候室內(nèi)植物之間的均勻性,減少了誤差并增加了統(tǒng)計(jì)能力。

值得注意的是,在評(píng)估基因修飾時(shí),相互分散原則也是重要的考慮因素。將轉(zhuǎn)基因植物從野生型對(duì)照中分離和隔離,將使人們無(wú)法自信地將觀察到的表型歸因于基因操縱,事實(shí)也的確如此。因此,將轉(zhuǎn)基因植物與野生型對(duì)照植物放在同一個(gè)氣候室中種植至關(guān)重要。 

統(tǒng)計(jì)方面的考慮

在統(tǒng)計(jì)學(xué)中,當(dāng)測(cè)試錯(cuò)誤地識(shí)別出處理之間的顯著差異而實(shí)際上沒(méi)有差異時(shí),就會(huì)出現(xiàn)I型錯(cuò)誤(見(jiàn)Box 1,Type I error)。當(dāng)α=0.05時(shí),指定的顯著性水平(α)決定了犯I型錯(cuò)誤的概率,我們接受的是在5%的范圍內(nèi)錯(cuò)誤識(shí)別處理之間的差異概率。第二類(lèi)錯(cuò)誤見(jiàn)Box 1,Type II error)發(fā)生在測(cè)試未能識(shí)別實(shí)際存在的處理差異時(shí);犯II型錯(cuò)誤的概率是β。提交I錯(cuò)誤的概率越高,提交II錯(cuò)誤的概率就越低,反之亦然。

統(tǒng)計(jì)冪 (1-β,statistical power)是正確識(shí)別給定α的處理之間的差異的概率。統(tǒng)計(jì)冪是由以下參數(shù)決定的:處理之間的差異;處理的集合方差;處理的level數(shù)k;試驗(yàn)單元數(shù) (n)。與處理相關(guān)的自由度,通常被稱為組間誤差自由度(v1, k-1),以及試驗(yàn)單元,通常被稱為組內(nèi)誤差自由度(v2, k(n-1))也影響統(tǒng)計(jì)功效。當(dāng)處理效果的大小增加時(shí),或者當(dāng)方差減小時(shí),尤其是當(dāng)n和相關(guān)的v2增加時(shí),統(tǒng)計(jì)冪顯著增加。因此,不正確地將亞單位作為試驗(yàn)單元錯(cuò)誤地夸大了統(tǒng)計(jì)能力,并極大地增加了I錯(cuò)誤的可能性。由于這些原因,研究人員在進(jìn)行試驗(yàn)研究時(shí),應(yīng)清楚地確定試驗(yàn)單元,并清楚的說(shuō)明試驗(yàn)單元的個(gè)數(shù),自由度與他們的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析。在本文的生長(zhǎng)室示例1B中,每個(gè)生長(zhǎng)室中的植物并不是獨(dú)立地受到CO2處理,為了統(tǒng)計(jì)分析的目的,不能認(rèn)為是真正的實(shí)驗(yàn)重復(fù)(Box 1)。在本例中,重復(fù)的單位是生長(zhǎng)室,n=1表示每一個(gè)處理的level。

解決重復(fù)和分散問(wèn)題的常用方法

在試驗(yàn)過(guò)程中,通常會(huì)在生長(zhǎng)室之間進(jìn)行輪換處理,以減少潛在假現(xiàn)象的可能性。例如,圖1B所示實(shí)驗(yàn)的研究人員可能試圖通過(guò)在試驗(yàn)期間各氣候室之間輪轉(zhuǎn)植物及其CO2濃度處理來(lái)平衡各處理非預(yù)期的生長(zhǎng)室效應(yīng)。在試驗(yàn)期間在三個(gè)氣候室中進(jìn)行。這一作用可能確實(shí)減少了假室效應(yīng)的可能性,但并沒(méi)有消除它,因?yàn)椴煌抑g變化的影響可能具有時(shí)間成分。例如,可通過(guò)時(shí)間錯(cuò)開(kāi)處理方法進(jìn)行調(diào)整,即所有處理的相同生長(zhǎng)階段在同一個(gè)生長(zhǎng)室中。然而,盡管生長(zhǎng)室交換可以最大限度地減少生長(zhǎng)室效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響,但真正的實(shí)踐過(guò)程中卻并不能保證,也沒(méi)有解決初級(jí)不能獨(dú)立重復(fù)的核心問(wèn)題。

   面對(duì)有限的植物生長(zhǎng)資源,及時(shí)重復(fù)實(shí)驗(yàn)并將處理隨機(jī)分配到生長(zhǎng)室是一種可用于產(chǎn)生獨(dú)立重復(fù)的方法。當(dāng)不能在時(shí)間或空間上重復(fù)處理時(shí),可以考慮替代設(shè)計(jì)?;貧w方法可以用于分析對(duì)連續(xù)因素的響應(yīng),例如,有研究人員使用回歸方法分析了8個(gè)處理水平CO2未重復(fù)梯度的影響?;旌闲?yīng)模型可以通過(guò)使用隨機(jī)效應(yīng)來(lái)考慮試驗(yàn)設(shè)計(jì)的層次性來(lái)解釋偽重復(fù);然而,混合效應(yīng)模型不能解決由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)不足而導(dǎo)致的假?gòu)?fù)制,只有當(dāng)一種處理在多個(gè)試驗(yàn)單元中重復(fù)時(shí)才有幫助。簡(jiǎn)而言之,你無(wú)法通過(guò)分析來(lái)擺脫糟糕的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

    寫(xiě)在最后,盡管審稿專家或編輯對(duì)于偽重復(fù)的認(rèn)知和處理上存在著相當(dāng)大的差異,但對(duì)于研究者而言,試驗(yàn)的科學(xué)性和可信度從根本上取決于試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因此,在試驗(yàn)開(kāi)始前,如何進(jìn)行合理的、獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究者首要關(guān)注的問(wèn)題!

Doi:10.1093/jxb/erab268

編輯|Ewen

審核|菲戈

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