近年來，免疫檢查點抑制劑（如抗PD-1和抗PD-L1抗體）在癌癥治療中取得了顯著的成功，改變了許多晚期癌癥患者的預(yù)后。然而，并非所有患者對這些治療都有良好的反應(yīng)，因此尋找有效的生物標(biāo)志物以預(yù)測患者的治療反應(yīng)成為一個重要的研究方向 。

腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性：腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和淋巴結(jié)構(gòu)（如三級淋巴結(jié)構(gòu)，TLS）可能影響腫瘤的免疫逃逸和對免疫治療的反應(yīng)。因此，深入了解TLS的存在和成熟度對免疫治療反應(yīng)的影響是非常重要的。

TLS的潛在作用：已有研究表明，TLS的存在與腫瘤的免疫反應(yīng)相關(guān)，可能作為一種新的生物標(biāo)志物來預(yù)測患者對免疫治療的反應(yīng)。然而，關(guān)于TLS在不同類型癌癥中的作用及其與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)的研究。因此，研究團隊希望通過大規(guī)模的回顧性分析來填補這一知識空白。

臨床需求：對于晚期癌癥患者，仍然存在未滿足的醫(yī)療需求。通過識別能夠預(yù)測免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，研究可以幫助醫(yī)生更好地選擇適合的患者進行免疫治療，從而提高治療的有效性和安全性。這種個體化的治療策略對于改善患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。

患者選擇：

研究基于從三個獨立患者隊列中回顧性收集的數(shù)據(jù)，這些患者在2013年12月至2019年5月期間接受治療。納入標(biāo)準(zhǔn)包括年齡≥18歲、組織學(xué)確診的惡性腫瘤、不可切除和/或轉(zhuǎn)移性疾病、在免疫治療開始后至少進行一次腫瘤評估的影像學(xué)檢查，以及在免疫治療開始前可獲得的石蠟包埋腫瘤樣本。

治療和評估：

患者的治療由其主治醫(yī)生決定，最佳治療反應(yīng)根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)進行評估。無進展生存期（PFS）定義為從治療開始到疾病進展、死亡或最后一次患者聯(lián)系的時間；總體生存期（OS）定義為從治療開始到死亡或最后一次患者聯(lián)系的時間。

TLS篩查：

所有病例由兩位病理學(xué)家盲法評估，以確定TLS的存在及其成熟狀態(tài)。使用了多種染色技術(shù)，包括蘇木精-伊紅-藏紅色（HES）、免疫組化和免疫熒光染色，分析了腫瘤樣本的切片。

TLS成熟度的評估：

研究中對TLS的成熟度進行了評估，主要通過免疫熒光技術(shù)進行多參數(shù)分析，同時也實施了雙重CD20和CD23免疫染色，這種方法在常規(guī)病理實驗室中易于獲取。結(jié)果顯示，這兩種方法在91.9%的病例中得到了相同的結(jié)果。

統(tǒng)計分析：

采用單變量和多變量Cox回歸分析來評估PFS和OS的影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，mTLS的存在是預(yù)測客觀反應(yīng)的最顯著因素，并在調(diào)整其他預(yù)后因素后仍具有獨立的預(yù)測價值。

驗證隊列的使用：

為了確認(rèn)結(jié)果的可靠性，研究還分析了兩個獨立的驗證隊列。驗證隊列A包括131名在社區(qū)環(huán)境中接受治療的患者，驗證隊列B則包括81名參與MATCH-R研究的患者。結(jié)果顯示，在mTLS陽性組中，客觀反應(yīng)率和PFS均顯著提高。

倫理考慮：

研究獲得了機構(gòu)倫理審查委員會的批準(zhǔn)，并且所有患者均簽署了知情同意書，以確保研究的倫理合規(guī)性。

TLS的存在與患者預(yù)后相關(guān)：研究表明，成熟的三級淋巴結(jié)構(gòu)（mTLS）在腫瘤微環(huán)境中的存在與患者對免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)和生存率顯著相關(guān)。特別是在CD8 T細(xì)胞高浸潤的腫瘤中，mTLS的存在與改善的臨床結(jié)果相關(guān)。

B細(xì)胞的關(guān)鍵作用：B細(xì)胞在mTLS中發(fā)揮著重要作用，通過產(chǎn)生抗腫瘤抗體和調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，促進有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞不僅參與抗體的產(chǎn)生，還通過抗原呈遞增強CD8 T細(xì)胞的活化。

mTLS作為生物標(biāo)志物的潛力：mTLS的狀態(tài)被認(rèn)為是預(yù)測患者對免疫治療反應(yīng)的一個重要生物標(biāo)志物。研究結(jié)果顯示，mTLS的存在能夠獨立于PD-L1表達狀態(tài)，預(yù)測患者的生存和治療反應(yīng)，尤其是在PD-L1陰性患者中。

臨床應(yīng)用的前景：研究結(jié)果為將TLS作為生物標(biāo)志物用于選擇適合免疫治療的患者提供了直接證據(jù)。這一發(fā)現(xiàn)可能會推動未來的臨床試驗，評估通過特定治療誘導(dǎo)TLS形成的可能性，從而改善患者的治療結(jié)果。

未來研究的方向：盡管本研究提供了重要的見解，但仍需進一步的前瞻性研究來驗證TLS在不同癌癥類型中的作用及其機制。此外，探索如何通過治療手段促進TLS的形成，以增強免疫治療的效果，也是未來研究的重要方向。

三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS，Tertiary Lymphoid Structures）是指在腫瘤微環(huán)境中形成的淋巴樣組織，這些結(jié)構(gòu)通常由B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞組成。TLS的形成通常與慢性炎癥或腫瘤的存在有關(guān)，它們在腫瘤微環(huán)境中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

在癌癥治療中，TLS與免疫治療的效果密切相關(guān)。研究表明，成熟的TLS（mTLS）可以作為患者對免疫檢查點抑制劑（如抗PD-1/PD-L1抗體）反應(yīng)的預(yù)測因子。具體來說，mTLS的存在與更好的治療反應(yīng)和生存期相關(guān)，尤其是在PD-L1陰性患者中。這意味著，TLS的狀態(tài)可以幫助醫(yī)生選擇更有可能從免疫治療中受益的患者。

此外，TLS還可能通過促進抗腫瘤免疫反應(yīng)來增強治療效果。例如，TLS中的B細(xì)胞可以通過分泌抗體和細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，從而影響腫瘤的免疫反應(yīng)。因此，研究TLS的形成和功能可能為癌癥治療提供新的生物標(biāo)志物和治療策略

生物標(biāo)志物的潛力：研究表明，成熟的三級淋巴結(jié)構(gòu)（mTLS）與患者對抗PD-1/PD-L1抗體的反應(yīng)密切相關(guān)。mTLS的存在被認(rèn)為是預(yù)測患者免疫治療反應(yīng)的一個重要生物標(biāo)志物。這意味著在治療前評估腫瘤樣本中的mTLS狀態(tài)，可以幫助醫(yī)生識別出更有可能從免疫治療中獲益的患者。

獨立于PD-L1表達：研究發(fā)現(xiàn)，mTLS的狀態(tài)與患者的PD-L1表達水平無關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)尤其重要，因為許多現(xiàn)有的生物標(biāo)志物（如PD-L1表達）并不能有效預(yù)測所有患者的治療反應(yīng)。mTLS的存在可能為那些PD-L1陰性的患者提供了新的治療選擇和希望。

改善治療策略：了解mTLS在腫瘤微環(huán)境中的作用可能有助于開發(fā)新的治療策略。例如，研究表明某些治療（如化療和免疫檢查點抑制劑）可以促進TLS的形成，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。這為未來的臨床試驗和治療方案提供了新的方向。

個體化治療：通過將mTLS作為生物標(biāo)志物，醫(yī)生可以更好地進行個體化治療，選擇合適的患者進行抗PD-1/PD-L1療法，從而提高治療的有效性和安全性。這種個體化的方法有助于優(yōu)化資源的使用，并減少不必要的副作用。

多中心設(shè)置：研究在多個中心進行，確保樣本的多樣性和代表性。這種多中心設(shè)計有助于收集來自不同患者群體的數(shù)據(jù)，從而提高研究結(jié)果的普遍適用性。

樣本選擇：研究納入了接受免疫檢查點抑制劑治療的患者，并確保這些患者在治療前有可用的腫瘤組織樣本。樣本的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括患者在特定時間之前接受治療，以確保有足夠的隨訪時間來評估治療效果。

病理評估：研究團隊對腫瘤樣本進行了病理評估，特別是對三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的存在和成熟度進行了評估。使用了免疫熒光和雙重免疫染色等技術(shù)，以確保結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

數(shù)據(jù)收集與分析：研究收集了患者的臨床數(shù)據(jù)，包括生存期、無進展生存期（PFS）、治療反應(yīng)等。使用了單變量和多變量Cox回歸模型來識別與生存期和治療反應(yīng)相關(guān)的預(yù)后因素。這種統(tǒng)計分析方法能夠控制潛在的混雜因素，從而更準(zhǔn)確地評估m(xù)TLS的預(yù)測價值。

結(jié)果驗證：為了驗證結(jié)果的可靠性，研究還分析了兩個獨立的驗證隊列。這些驗證隊列的結(jié)果與主要研究結(jié)果相一致，進一步支持了mTLS作為預(yù)測因子的有效性 3。

倫理考慮：研究遵循倫理規(guī)范，確保患者的知情同意和數(shù)據(jù)的保密性。所有數(shù)據(jù)的使用都經(jīng)過倫理委員會的批準(zhǔn)，確保研究的合規(guī)性。

圖1 | 成熟的三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）可以預(yù)測接受免疫檢查點抑制劑治療的癌癥患者的預(yù)后。a，腫瘤中TLSs的存在通過HES染色和CD3與CD20的雙重免疫組化染色（CD3和CD20分別染成棕色和紫色）進行了系統(tǒng)篩查。PD-L1狀態(tài)通過CD8和PD-L1的雙重免疫組化染色進行評估（CD8和PD-L1分別染成棕色和紫色）。TLSs的成熟度在TLS陽性腫瘤中使用多重免疫熒光檢測評估，結(jié)合了CD4、CD8、CD20、CD21和CD23標(biāo)記。所示案例為與成熟TLSs相關(guān)的原發(fā)性胰腺腺癌，在HES染色中顯示出明顯的生發(fā)中心。結(jié)果代表了分析的540個腫瘤（發(fā)現(xiàn)隊列，n = 328；驗證隊列A，n = 131；驗證隊列B，n = 81）。該腫瘤PD-L1陰性，CD8 T細(xì)胞淋巴細(xì)胞密度為154 mm?2。免疫熒光檢測顯示生發(fā)中心內(nèi)有密集的CD23 濾泡樹突細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。黑色箭頭突出顯示樣本中的腫瘤細(xì)胞。底部的圖像顯示了每個單一標(biāo)記的表達及其對應(yīng)的熒光光譜。b，根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)，按TLS狀態(tài)定義的反應(yīng)率：缺失（無TLSs；n = 223名患者）、初級TLSs（iTLSs；n = 21名患者）或成熟TLSs（mTLSs；n = 84名患者）。OR，客觀反應(yīng)；PD，進展性疾?。籗D，穩(wěn)定疾病。統(tǒng)計顯著性通過卡方檢驗確定。c，根據(jù)總體生存（OS）終點（免疫治療開始后≤24個月與>24個月的總體生存）特征化的缺失或存在初級TLSs或成熟TLSs的患者比例。統(tǒng)計顯著性通過卡方檢驗確定。在b和c中，n = 328名患者。d,e，328名接受抗-PD-1或抗-PD-L1拮抗劑治療的癌癥患者的無進展生存期（PFS）（d）和總體生存期（e）的Kaplan-Meier曲線，根據(jù)mTLS狀態(tài)（紅色曲線：富含mTLS的腫瘤；藍色曲線：mTLS陰性腫瘤）。每個x軸下方的數(shù)字表示風(fēng)險患者的數(shù)量，括號中的數(shù)字表示事件的數(shù)量。統(tǒng)計顯著性通過對數(shù)秩檢驗確定

表1 | TLS陽性腫瘤患者與無TLS腫瘤患者的臨床特征

圖2 | 成熟的腫瘤淋巴樣結(jié)構(gòu)（TLSs）能夠預(yù)測對免疫檢查點抑制的反應(yīng)，與PD-L1表達狀態(tài)無關(guān)。a，對于每位患者，從上到下：CD8和PD-L1的雙重染色（CD8為棕色，PD-L1為紫色）；CD4（藍色）、CD8（黃色）、CD20（橙色）、CD21（綠色）和CD23（粉色）的多重免疫熒光檢測；以及在治療開始時和8-16周后獲得的計算機斷層掃描（CT）。紅色箭頭指向腫瘤靶病灶。患者1為mTLS陽性的肺腺癌，CD8 T淋巴細(xì)胞密度為159 mm?2，PD-L1狀態(tài)為陰性，顯示出對免疫治療的近乎完全反應(yīng)?；颊?被診斷為mTLS陽性的咽部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，PD-L1陰性，CD8 T淋巴細(xì)胞密度為124 mm?2，免疫治療后完全反應(yīng)?；颊?被診斷為mTLS陽性的微衛(wèi)星穩(wěn)定性結(jié)直腸腺癌，CD8 T淋巴細(xì)胞密度為115 mm?2，PD-L1比例低（TPS評分=1%），在免疫治療中有近乎完全反應(yīng)。患者4被診斷為晚期肺腺癌，PD-L1高表達且未檢測到TLS，免疫治療后病情進展。結(jié)果代表了分析的540個腫瘤（發(fā)現(xiàn)隊列，n = 328；驗證隊列A，n = 131；驗證隊列B，n = 81）。b-e，Kaplan-Meier曲線描繪了無mTLS（Neg）與有mTLS（Pos）患者的無進展生存期（PFS，左）和總體生存期（中），以及在PD-L1陰性腫瘤患者（b；定義為TPS評分<1%；n = 258患者）、PD-L1陽性腫瘤患者（c；定義為TPS評分>1%；n = 70患者）、驗證隊列A患者（d；n = 131）和驗證隊列B患者（e；n = 81）中獲得的反應(yīng)率直方圖（右），所有患者均接受了抗PD-1或抗PD-L1拮抗劑治療。統(tǒng)計顯著性通過對數(shù)秩檢驗確定。每個x軸下方的數(shù)字表示風(fēng)險患者的數(shù)量，括號中的數(shù)字為事件數(shù)量。

表2 根據(jù)患者中mTLSs的存在情況、PD-L1狀態(tài)和CD8密度的反應(yīng)率

表3 無變量和多變量Cox分析用于無進展生存期（PFS）和總體生存期（OS）

擴展數(shù)據(jù)圖1 | 評估腫瘤中TLS的存在及其成熟階段。a：這是一個TLS陽性的原發(fā)性胰腺腺癌，伴有154/mm2的CD8 T淋巴細(xì)胞密度，PD-L1為陰性。TLS在HES切片上用黑線勾勒，突出其與腫瘤細(xì)胞的鄰近關(guān)系。比例尺表示300 μm。代表分析的540個腫瘤（發(fā)現(xiàn)隊列n = 328，驗證隊列A n = 131，驗證隊列B n = 81）。b：該面板展示了在腫瘤樣本中觀察到的未成熟和成熟TLS的代表性例子。上面板：在一個伴有154/mm2的CD8 T淋巴細(xì)胞密度且PD-L1為陰性的原發(fā)性胰腺腺癌中檢測到這個成熟的TLS。成熟TLS的定義是存在CD23陽性樹突狀細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的免疫熒光（注意，在這種情況下，HES上可見的生發(fā)中心的存在已經(jīng)診斷為成熟TLS）。下面板：該圖顯示了在一個原發(fā)性肺腺癌中檢測到的未成熟TLS，同時顯示出372/mm2的高CD8 T淋巴細(xì)胞浸潤和PD-L1 TPS評分為1%。該腫瘤僅與未成熟TLS相關(guān)，未顯示生發(fā)中心，也沒有CD23陽性樹突狀細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的免疫熒光。代表分析的540個腫瘤（發(fā)現(xiàn)隊列n = 328，驗證隊列A n = 131，驗證隊列B n = 81）。從左到右的圖片對應(yīng)于1）蘇木精-伊紅-藏紅花（HES）染色，2）CD3/CD20的雙重免疫組化染色（CD3為棕色，CD20為紫色），3）CD8/PD-L1的雙重免疫組化染色（CD8為棕色，PD-L1為紫色），4）CD4（藍色）、CD8（黃色）、CD20（橙色）、CD21（綠色）和CD23（粉色）的多重免疫熒光檢測。HES圖像上的比例尺分別表示上面板50 μm和下面板100 μm。黑色裁剪箭頭突出樣本中的腫瘤細(xì)胞。

擴展數(shù)據(jù)圖2 | 根據(jù)CPS PD-L1評分評估TLS狀態(tài)的預(yù)測價值?？陀^反應(yīng)率（OR：客觀反應(yīng)，SD：穩(wěn)定疾??；PD：進展性疾??；卡方（χ2）檢驗）以及328名接受抗PD1/PD-L1拮抗劑治療的癌癥患者的無進展生存期（PFS，log-rank檢驗）和總體生存期（OS，log-rank檢驗）的Kaplan-Meier曲線，根據(jù)CPS PD-L1評分（a：CPS PD-L1 < 1，N = 223名患者；b：CPS PD-L1 ≥ 1，N = 105名患者）和TLS狀態(tài)（紅色曲線：成熟TLS陽性腫瘤；藍色線：成熟TLS陰性腫瘤）。

擴展數(shù)據(jù)圖3 | 根據(jù)T CD8細(xì)胞密度評估TLS狀態(tài)的預(yù)測價值?？陀^反應(yīng)率（OR：客觀反應(yīng)，SD：穩(wěn)定疾病，PD：進展性疾病；卡方（χ2）檢驗）以及328名接受抗PD1/PD-L1拮抗劑治療的癌癥患者的無進展生存期（PFS，log-rank檢驗）和總體生存期（OS，log-rank檢驗）的Kaplan-Meier曲線，根據(jù)T CD8 細(xì)胞密度（a：低密度，N = 165名患者；b：高密度，N = 163名患者）和TLS狀態(tài)（紅色曲線：成熟TLS陽性腫瘤；藍色線：成熟TLS陰性腫瘤）。

擴展數(shù)據(jù)圖4 | 根據(jù)TLS狀態(tài)評估癌癥患者的結(jié)果（不包括非小細(xì)胞肺癌）。a) 客觀反應(yīng)率（OR：客觀反應(yīng)，SD：穩(wěn)定疾病，PD：進展性疾?。豢ǚ剑é?）檢驗）以及201名接受抗PD1/PD-L1拮抗劑治療的癌癥患者（所有腫瘤類型，除了非小細(xì)胞肺癌）的無進展生存期（PFS，b）和總體生存期（OS，c）的Kaplan-Meier曲線，根據(jù)TLS狀態(tài)（紅色曲線：成熟TLS陽性腫瘤；藍色線：成熟TLS陰性腫瘤）。

擴展數(shù)據(jù)圖5 | TLS篩查與病理學(xué)和免疫組化病理學(xué)的比較，以及與免疫熒光篩查（Petitprez等人的方法）。第一行：明顯的成熟TLS，伴有CD23 濾泡樹突狀細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。第二行：通過顯示樹突狀形態(tài)的孤立CD23 細(xì)胞定義的成熟TLS。左到右列的圖片對應(yīng)于1) 蘇木精-伊紅-藏紅花（HES）染色，2) CD23（粉色）和CD20（橙色）的多重免疫熒光檢測，3) CD23/CD20的雙重免疫組化染色（CD23為棕色，CD20為紅色）。HES圖像上的比例尺表示50微米。代表分析的540個腫瘤（發(fā)現(xiàn)隊列n = 328，驗證隊列A n = 131，驗證隊列B n = 81）。

只有少數(shù)患者從抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（抗-PD-1）或抗程序性死亡配體1（抗-PD-L1）單克隆抗體中獲得長期臨床益處。三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）的存在與多種腫瘤類型的生存率改善相關(guān)。在這里，我們通過對三組獨立癌癥患者進行大規(guī)?；仡櫺苑治觯@些患者接受了抗-PD-1或抗-PD-L1抗體治療，我們發(fā)現(xiàn)成熟的TLSs的存在與改善的客觀反應(yīng)率、無進展生存期和總體生存期相關(guān)，這與PD-L1表達狀態(tài)和CD8 T細(xì)胞密度無關(guān)。這些結(jié)果為使用TLS檢測來選擇更有可能從免疫檢查點阻斷中受益的患者鋪平了道路。

Only a minority of patients derive long-term clinical benefit from anti-programmed cell death protein 1 (anti-PD-1) or anti-programmed death-ligand 1 (anti-PD-L1) monoclonal antibodies. The presence of tertiary lymphoid structures (TLSs) has been associated with improved survival in several tumor types. Here, using a large-scale retrospective analysis of three independent cohorts of patients with cancer who were treated with anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibodies, we show that the presence of mature TLSs was associated with
improved objective response rates, progression-free survival and overall survival, independent of PD-L1 expression status and CD8 T cell density. These results pave the way for using TLS detection to select patients who are more likely to benefit from immune checkpoint blockade