【原】文獻閱讀-Empaglizin通過NOX-4/ROS/p38途徑減輕輻射誘導的造血損傷

無逐 2024-05-10 發(fā)布于浙江

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文獻來源：Huo Q, Yue T, Li W, Wang X, Dong Y, Li D. Empagliflozin attenuates radiation-induced hematopoietic damage via NOX-4/ROS/p38 pathway. Life Sci. 2024 Mar 15;341:122486. doi: 10.1016/j.lfs.2024.122486. PMID: 38331314.

摘要

目的：輻射對造血系統(tǒng)造成嚴重損害和功能抑制。這篇文章研究了empagliflozin（恩格列凈）這種藥物對輻射誘導的造血損傷的影響，以期為這類損傷提供新的預防方法。

方法和材料：小鼠口服empagliflozin 1 h 后給予4 Gy全身照射（TBI），連續(xù)給藥6天。照射后第10天處死，檢測造血細胞中的活性氧（ROS）水平及其調(diào)節(jié)機制。采用集落形成單位粒細胞巨噬細胞法和骨髓移植法評估骨髓細胞的功能。

主要發(fā)現(xiàn)：對于接受1 Gy輻射的骨髓細胞，empagliflozin可提高細胞活力，降低ROS水平，減輕細胞凋亡。empagliflozin顯著減輕了4 Gy TBI小鼠造血系統(tǒng)的電離輻射損傷，增加了外周血細胞計數(shù)，并提高了造血干細胞的比例和功能。這些作用可能與NOX-4/ROS/p38通路介導的造血干細胞中MAPK的抑制有關(guān)。empagliflozin通過影響Nrf-2的表達和增強谷胱甘肽過氧化物酶的活性來促進活性氧的清除。此外，empagliflozin還能夠通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶點緩解了代謝異常。

意義：這項研究表明，empagliflozin可以減輕輻射誘導的造血干細胞損傷，提示empagliflozin或許可以作為防止輻射誘導的造血系統(tǒng)損傷的新型潛在藥物。

背景

科學問題：造血系統(tǒng)對輻射非常敏感，受到輻射損傷后造血干細胞自我更新和再生能力減弱，而目前治療的藥物有限。因此，有必要尋找能夠有效防護輻射的藥物。

邏輯基礎：活性氧（ROS）在暴露于輻射引起的細胞和機體損傷中起著關(guān)鍵作用。empagliflozin是一種新型降糖藥，通過高選擇性抑制鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運體2（SGLT-2）發(fā)揮作用，通過促進腎葡萄糖排泄降低血糖水平。empagliflozin在各種器官中顯示出抗炎和抗氧化作用。研究表明SGLT-2抑制劑達格列辛可以增強粒細胞集落刺激因子刺激后造血干細胞的動員，改善糖尿病相關(guān)損傷。然而，empagliflozin減輕ir誘導的造血干細胞祖細胞（HSPCs）損傷的能力仍未得到充分的探索。

科學假說：empagliflozin具有抗氧化作用，或許可以通過降低ROS水平，緩解輻射造成的造血系統(tǒng)損傷。

結(jié)果解讀

empagliflozin可減少輻射誘導的BM細胞損傷

為了測定empagliflozin對輻射損傷的影響，研究者首先建立了輻射暴露的骨髓細胞模型，然后對這些細胞進行不同濃度empagliflozin的處理。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)1000 nmol/L, 500 nmol/L and 250 nmol/L的empagliflozin對骨髓細胞均沒有毒性，而且濃度為500 nmol/L 的empagliflozin可以顯著增強接受1Gy 電離輻射（IR）的骨髓細胞的活性（圖1A-B）。

隨后研究了empagliflozin對BM細胞ROS水平和凋亡率的影響。結(jié)果顯示濃度為1000 nmol/L、500 nmol/L和250 nmol/L的empagliflozin可顯著降低輻照BM細胞中的ROS水平（圖1C-D）。值得注意的是，500 nmol/L濃度的empagliflozin也顯著減輕了IR誘導的細胞凋亡（圖1E-F）。

綜上所述，empagliflozin在體外可以減輕輻射對造血細胞產(chǎn)生的損傷。

empagliflozin提高脾臟系數(shù)和外周血細胞計數(shù)

為了評估empagliflozin在輻射暴露后對小鼠的潛在保護作用，檢測了其對體重、脾臟大小相對于體重（脾臟系數(shù)）和外周血計數(shù)等參數(shù)的影響。結(jié)果顯示，empagliflozin似乎對TBI小鼠的體重沒有影響（圖2B），但是它減輕了TBI引起的脾臟系數(shù)的降低（圖2J）。先前研究報道了放療后患者患糖尿病的風險增加。在這項研究中，暴露于4Gy TBI顯著提高了小鼠的血糖水平，而empagliflozin顯著降低了血糖水平。而且empagliflozin對對照組小鼠的血糖水平?jīng)]有明顯的影響（圖2I）。鑒于造血系統(tǒng)對IR的敏感性，外周血細胞計數(shù)結(jié)果表明，與TBI組小鼠相比，empagliflozin顯著增加小鼠白細胞（淋巴細胞%（LY%）、中性粒細胞%（NE%）、紅細胞（紅細胞）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）（圖2C-H)。這些發(fā)現(xiàn)提示empagliflozin在減輕輻射誘導的造血損傷方面的治療潛力。

empagliflozin挽救了造血系統(tǒng)輻射損傷

為了進一步研究empagliflozin對造血系統(tǒng)的保護作用，該研究評估了小鼠各類細胞群的數(shù)量和比例，包括BMMNCs、HPCs、LSKs和LT-HSCs。IT-HSC具有獨特的屬性，包括自我更新能力和控制造血室間擴張的能力，同時保留分化為HSPC和末端亞群[31]的潛力。采用流式細胞術(shù)分析骨髓中造血細胞的比例（圖3A-C）。結(jié)果顯示與對照組相比，暴露于4 Gy TBI導致HPCs、LSKs和LTHSCs的比例和數(shù)量均減少。empagliflozin顯著增加了HPCs、LSKs和LT-HSC的比例和數(shù)量（圖3D-E），對CMPs、GMP和MEPs的比例無顯著影響。這些發(fā)現(xiàn)進一步表明了免疫在減輕輻射誘導的造血損傷方面的治療潛力。

empagliflozin影響TBI小鼠的造血干祖細胞（HSPCs）功能

BMT是評估造血干細胞自我更新和再群體潛力的金標準。該研究使用CFU方法評估了免疫對HSPCs克隆功能的影響，并通過BMT評估了移植能力。采用CFU-GM法評價empagliflozin對克隆功能的影響。結(jié)果表明，4Gy TBI顯著抑制了克隆功能，而empagliflozin處理增加了CFU-GMs的形成（圖4A）。移植后一個月的外周血分析顯示，empagliflozin顯著減輕了TBI誘導的髓系分化偏倚。此外，移植后2個月，供體細胞和T細胞的供體細胞百分比仍顯著高于TBI組（圖4B-C）。移植后2個月，empagliflozin也顯著提高了BM細胞中供體細胞和T細胞的比例（圖4D），但髓系細胞無顯著性差異，與血液分析結(jié)果一致。移植后2個月脾臟檢測結(jié)果顯示，empagliflozin顯著增加了TBI小鼠脾臟供體細胞總比例、T細胞比例和B細胞比例（圖4F）。

empagliflozin降低tbi誘導的造血細胞ROS水平，并減少γH2AX表達

ROS包含一組化學活性含氧分子，其特征是其不穩(wěn)定性高，其中包括氧自由基和非自由基分子。輻射暴露導致的活性氧升高會使DNA損傷持續(xù)下去，從而導致堿基脫落等事件。組蛋白2A變體（H2AX）中保守氨基酸序列的磷酸化是對細胞DNA損傷的反應。為了闡明empagliflozin的治療機制，檢測了造血細胞中ROS水平和γH2AX的表達。結(jié)果顯示empagliflozin可減輕TBI誘導的HSPCs和IT-HSC中ROS水平的升高(圖5A-B)。此外，在一定程度上，在輻照后的LSKs中，γH2AX的表達略有降低(圖5C-D)。這些結(jié)果表明，免疫可能通過降低ROS水平和減輕DNA損傷來保護輻射誘導的造血損傷。

empagliflozin抑制NOX-4/p38-MAPK的表達

NOX-4/ROS/p38-MAPK信號通路參與造血干細胞的輻射損傷已被報道。本研究通過流式細胞術(shù)評估empagliflozin對NOX-4和p38表達的影響。實驗結(jié)果顯示，empagliflozin顯著減輕了tbi誘導的造血細胞中NOX-4表達和p38磷酸化的升高（圖6A-D）。對分選的造血細胞的qRT-PCR分析顯示，empagliflozin顯著降低了TBI后LSK細胞中NOX-4和p-38水平（圖6E-F），免疫熒光分析也進一步證實了這一點（圖6G-H）。

empagliflozin增加脾臟抗氧化酶含量

Nrf-2在ROS的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，empagliflozin增加了LSK細胞中Nrf-2的表達（圖7A-B）。體內(nèi)的抗氧化酶，包括GXHPx、總SOD和CAT，其功能是消除生物體內(nèi)多余的活性氧。此外，MDA的定量作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，導致蛋白質(zhì)、核酸等重要大分子的交聯(lián)和聚合，是反映機體潛在抗氧化能力的關(guān)鍵參數(shù)。如圖7C所示，4Gy TBI后，脾臟中GSH-Px、SOD和CAT活性顯著降低，MDA水平升高，empagliflozin可以逆轉(zhuǎn)這些變化。這些發(fā)現(xiàn)表明，empagliflozin能夠通過提高抗氧化酶水平和Nrf-2的表達來改善過度氧化應激。

empagliflozin通過mTOR調(diào)節(jié)TBI誘導的代謝異常

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞生長和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它促進了合成代謝過程，如核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)、核苷酸、脂肪酸的合成和脂質(zhì)，并抑制分解代謝過程，如自噬。值得注意的是，IR能夠激活mTOR，介導成體干細胞的衰老，最終導致組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)empagliflozin顯著降低了TBI誘導的血糖水平（圖2I）。繼續(xù)研究mTOR的表達顯示，在4Gy TBI后，HPC、LSK和LTHSC細胞中mTOR的表達顯著上調(diào)。empagliflozin顯著降低了造血細胞中mTOR的表達（圖8A-B）。通過RT-PCR和免疫熒光分析一致證實了這一趨勢（圖8C-E）。以上結(jié)果表明，empagliflozin可以通過減少mTOR的表達和協(xié)調(diào)細胞代謝過程來減輕tbi誘導的造血損傷。