【原】多基因同時表達(dá)時，選IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點）還是2A肽（自我剪切肽）？

智者不學(xué)生物 2024-02-04 發(fā)布于上海

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很多實驗都需要同時表達(dá)多個基因，具體方法包括兩種或多種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染、使用多個或雙向啟動子，或者構(gòu)建雙順反子或多順反子載體。多順反子載體可以同時表達(dá)來自同一個mRNA的兩種或多種獨立的蛋白質(zhì)。目前，雙順反子載體或者多順反子載體主要采用2種策略，如下圖所示：

策略（1）用IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點）來同時表達(dá)基因1和基因2，如下圖所示。

關(guān)于IRES的詳細(xì)內(nèi)容可以瀏覽往期文章：

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）的原理、方法和應(yīng)用

策略（2）用2A肽（自我剪切肽）來同時表達(dá)基因1和基因2，如下圖所示。

關(guān)于2A肽的詳細(xì)內(nèi)容可以瀏覽往期文章：

什么是2A肽？2A肽在蛋白串聯(lián)表達(dá)、病毒學(xué)和疫苗研究中的應(yīng)用

IRES和2A肽介導(dǎo)的多基因表達(dá)模式圖（圖片來源于addgene blog）

為什么要選擇多基因串聯(lián)表達(dá)（多順反子載體）？

很多時候我們并不是直接檢測目標(biāo)基因的表達(dá)，而是開發(fā)了新的方法來將目的基因和報告基因（如熒光基因或抗性基因或熒光素酶基因等）同時表達(dá)。利用這些報告基因能夠輕松篩選或選擇高水平表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞。多順反子質(zhì)?？梢源_保任何表達(dá)標(biāo)記基因的陽性細(xì)胞也應(yīng)該表達(dá)目的基因，因為它們都來自相同的轉(zhuǎn)錄本翻譯而來。

盡管可以通過使用具有多個單獨表達(dá)盒的質(zhì)粒來驅(qū)動多個基因的共表達(dá)，但從同一個轉(zhuǎn)錄本中表達(dá)基因有時是有利的，特別是當(dāng)只有一部分質(zhì)粒被包裝用于病毒遞送時，或者兩個或多個基因之間的相對表達(dá)水平很重要。

多順反子載體表達(dá)多個基因的原理：

科學(xué)家們在單股正鏈RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律，從而能夠從單個轉(zhuǎn)錄本中有效地翻譯多個基因。

（1）IRES元件（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點）原理

真核生物的翻譯通常從5'帽子開始，因此每個mRNA只翻譯一次。然而，一些雙順反子載體利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）元件來讓單個mRNA 可以從多個位點開始翻譯。IRES驅(qū)動的翻譯起始可以不依賴于mRNA的5’末端的帽子結(jié)構(gòu)。

圖片來源于addgene blog

在上圖中，可以看到 IRES 元件充當(dāng)另一個核糖體募集位點，從而導(dǎo)致來自單個mRNA的兩種蛋白質(zhì)的共表達(dá)。

IRES最初是在脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA中發(fā)現(xiàn)的，能夠促進(jìn)真核細(xì)胞中病毒基因組的翻譯。從那時起，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種IRES序列，大部分IRES來自于病毒，但也有一些來自細(xì)胞的mRNA。

IRES元件非常有用，常見于雙順反子載體中。但是，它們確實有一些缺點。這些元件非常大（500-600 bp），可能會在包裝能力有限的病毒轉(zhuǎn)移載體中占用寶貴的空間。此外，使用 IRES 元件一次表達(dá)兩個以上的基因可能會失敗。有大量研究發(fā)現(xiàn)，IRES下游基因的表達(dá)量通常低于IRES上游基因的表達(dá)量。

（2）2A肽（自我剪切肽）原理

為了克服IRES元件的一些缺點，科學(xué)家們將“自裂解”2A肽改編到多順反子載體中。這些肽最初也是在小核糖核酸病毒中發(fā)現(xiàn)，2A肽長度很短（約20個氨基酸），并且從相同的mRNA中產(chǎn)生的多個基因的表達(dá)量是一樣的?！白粤呀狻笨赡懿⒉煌耆珳?zhǔn)確，因為2A肽被認(rèn)為通過使核糖體跳過2A元件C 末端肽鍵的合成來發(fā)揮作用，導(dǎo)致2A序列末端與下游下一個肽之間的分離。“裂解”發(fā)生在2A肽末端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）殘基之間，這意味著上游順反子將在末端添加一些額外的殘基，而下游順子將從脯氨酸開始。

如果大家想將目的基因與熒光蛋白或其他報告基因共表達(dá)，最簡單的方法是從已經(jīng)克隆了多順反子元件和報告基因的質(zhì)粒上替換目的基因。另外，還可以將2A肽和報告基因作為一個整體從質(zhì)粒上PCR下來，然后插入到目的基因的表達(dá)載體上去。

IRES和2A肽該選哪個？

（1）當(dāng)要求2個基因表達(dá)量相同時，采用2A肽。因為IRES上游基因的表達(dá)量通常高于IRES下游基因的表達(dá)量。

（2）由于2A肽的裂解發(fā)生在其C末端的GP之間，因此2A肽會和protein 1融合，可能會影響protein 1的定位和功能（如下圖所示）。并且2A肽在GP之間裂解會導(dǎo)致P氨基酸（脯氨酸）位于protein 2的起始位置，也可能對protein 2的定位和功能產(chǎn)生影響。此時建議使用IRES元件。