由于最近持續(xù)的技術創(chuàng)新，微流控系統(tǒng)越來越多地為生物領域的研究人員提供了更多的新可能性，特別是在促進高通量分析、便攜性和并行化方面。微流控設備所具備的優(yōu)勢：即所需的化學物質(zhì)和樣品消耗大大降低，提供的能量和質(zhì)量傳遞增加，以及它們相對較小的尺寸。有可能在生物領域的每個子領域得到利用。到目前為止，大多數(shù)報道的設備都已被用于促進醫(yī)療保健、制藥和工業(yè)應用。

在本章中，我們考慮了生物領域研究的三種主要應用類型：全細胞應用、酶應用以及檢測和分析，并重點介紹了在每種類型下成功應用的一些特定微流控系統(tǒng)。

1.全細胞應用

1.1細胞分選與細胞分離

從復雜樣品中分離特定細胞和鑒定單個細胞內(nèi)的關鍵特性是許多生物領域共同的兩個重要目標。具有更高生產(chǎn)力、特定尺寸、光學特性或其他特殊特性的細胞通?？梢允褂梅诌x和分離手段進行鑒定——由于生物領域都采用了這種過程，因此開發(fā)出的許多微流控設備正是考慮到了這些應用。

有許多不同的方法可以用來將目標細胞與包含它的樣本分離。雙電泳是一種特別流行的方法，經(jīng)常用于基于電特性的差異來分離細胞，因為它是一種無標記的方法，不需要任何復雜而費力的預處理或標記去除步驟。郭等人報告了使用該技術開發(fā)小型微流控阻抗細胞儀的成功，該細胞儀用于從紅細胞中檢測和計數(shù)癌癥細胞（見圖1）。當與計算機輔助的結(jié)果自動分析相結(jié)合時，他們的微流控設備的精度與傳統(tǒng)的流式細胞儀相當，后者是一種體積龐大的臺式機器，而且需要對細胞進行熒光標記。同樣，Do等人開發(fā)了一種用于腫瘤細胞檢測的微流控富集平臺，該平臺使用介電電泳將腫瘤細胞引導到微流控系統(tǒng)的中心，將靶細胞與抗體結(jié)合，并使用內(nèi)置電容傳感器來識別細胞類型。Deng等人還利用不同頻率設置下細胞的相互作用行為對不同脂質(zhì)含量的微藻進行分類，用于生物燃料生產(chǎn)。細胞分選和檢測對于食品生產(chǎn)和生物醫(yī)學生產(chǎn)中的病原體檢測至關重要，雖然離心和隨后的培養(yǎng)步驟傳統(tǒng)上被用于檢測細菌或其他生物體，但Cheng等人制造了一種集成的介電泳芯片，該芯片成功地用于連續(xù)分選和捕獲大腸桿菌，乳酸桿菌和白色念珠菌。

圖1 一種用于識別循環(huán)腫瘤細胞（CTC）和紅細胞（RBCs）的微流控系統(tǒng)。a具有嵌入式Ag/AgCl電極的微流控系統(tǒng)的示意圖。b工作芯片中分離區(qū)域的詳細視圖。c完整的微流控系統(tǒng)。d CTC和RBCs分離的結(jié)果。

如前所述，用于細胞分離和篩選的微流控系統(tǒng)在生物領域的許多領域具有巨大的潛力。雖然這里顯示的例子處于實驗室階段，但這些系統(tǒng)的獨特功能，顯示出這些設備部署在帶有自動泵的小型系統(tǒng)中的巨大前景。

1.2細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)是生物領域研究許多方面的關鍵組成部分：既可以直接生產(chǎn)細胞、蛋白質(zhì)或其他細胞產(chǎn)物，也可以分析和更好地了解細胞行為。細胞培養(yǎng)方案通常取決于特定細胞類型來源的自然環(huán)境。例如，來自動物組織的細胞通常需要粘附在表面或基質(zhì)（模仿動物體內(nèi)有機存在的細胞外基質(zhì)），而微藻、酵母和細菌通?？梢詰腋≡诹黧w介質(zhì)中生長。

微流控研究的另一個日益流行的領域是單細胞培養(yǎng)和分析。細胞在其生理學中可能表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，因此，生長和產(chǎn)量的大量測量只能反映聚集細胞群體的平均值。在單細胞水平上進行的研究通常被認為更準確、更具信息性，但分離細胞進行單細胞培養(yǎng)可能具有挑戰(zhàn)性。可以通過幾種不同的方式來應對這一挑戰(zhàn)。一種選擇是使用液滴微流控在不混溶流體（如油）中產(chǎn)生細胞培養(yǎng)液的微小液滴，從而隨機分離這些液滴中的單個細胞。這項技術已經(jīng)成功地用于細菌、酵母和其他懸浮細胞系。使液滴微流控包括海藻酸鹽水凝膠也可以培養(yǎng)適合培養(yǎng)組織、癌癥細胞和干細胞的粘附細胞。另一種技術是使用微孔，將細胞裝載到具有多個微孔（大小從幾十到數(shù)百μm不等）的材料上，并且這些微孔的大小使得只有單個細胞才能進入其中。然后沖洗掉未牢固固定在這些孔中的細胞。然而，微孔技術帶來的一個挑戰(zhàn)是需要在培養(yǎng)期內(nèi)為細胞生長提供足夠的面積。

并行化是微流控系統(tǒng)提供的另一個關鍵優(yōu)勢。為了便于并行化，微流控系統(tǒng)可以結(jié)合幾個具有流體輸入和輸出通道的培養(yǎng)室。Gómez-Sj?berg等人開發(fā)了一個具有96個獨立培養(yǎng)室的系統(tǒng)，每個培養(yǎng)室都可以單獨處理種子密度、培養(yǎng)基組成和喂養(yǎng)時間表的變化。此外，這些單獨的培養(yǎng)室也具有相對較小的體積，僅為60 nL，從而顯著降低了培養(yǎng)基和化學物質(zhì)的消耗。利用這一原理，Schmitz等人已經(jīng)證明了一種用于單細胞平行培養(yǎng)的微流控系統(tǒng)，這為在培養(yǎng)基灌注過程中進行顯微鏡觀察開辟了可能性（見圖2）。Heuer等人提出了另一種利用并行化技術進行抗菌藥物敏感性測試的微流控系統(tǒng)，該系統(tǒng)將測試時間降至90分鐘，而目前的臨床實踐需要超過8小時。

圖2 用于單細胞培養(yǎng)和觀察的微流控系統(tǒng)。a具有用于介質(zhì)灌注的管連接的微流控芯片。b培養(yǎng)室設置示意圖，其中多個生長室連接到培養(yǎng)基供應通道。c單個細胞隨時間生長的實驗示意圖概述。d培養(yǎng)過程中不同時間CHO-K1細胞的顯微鏡圖像。

使用微流控進行細胞培養(yǎng)很可能是未來的標準做法。特別是器官芯片設備，可以提供更高質(zhì)量的療效和安全性數(shù)據(jù)，而無需傷害和殺死動物，對藥物開發(fā)至關重要。

2.酶的應用

生物領域不僅包括細胞本身的技術用途，還包括其產(chǎn)品（特別是但不限于酶）的技術用途。在食品工業(yè)、制藥工業(yè)，甚至精細化學品的生產(chǎn)中酶對生物化學反應的催化具有重要意義。事實上，并不是夸大酶在許多商業(yè)應用中的重要性和普遍性——舉一個非常普通的例子，如果沒有酶，我們就不會有洗衣機和洗碗機用的洗滌劑。與細胞應用非常相似，許多酶應用也將從微流控技術提供的優(yōu)勢中受益匪淺。

2.1酶篩選

旨在識別新酶的天然產(chǎn)物篩選過程大大受益于試劑消耗率的降低和相對較高的產(chǎn)量。Ochoa等人創(chuàng)建了一種液滴微流控篩選系統(tǒng)，通過將高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)連接到液滴微流系統(tǒng)上來檢測天然提取物中的酶抑制劑，從而產(chǎn)生含有酶（芽孢桿菌神經(jīng)酰胺酶）、熒光報告底物。液滴微流控的這種創(chuàng)造性使用使它們能夠顯著減少樣品體積，并使酶和底物體積顯著減少50倍。

2.2酶生產(chǎn)

雖然酶的發(fā)現(xiàn)和進化是酶研究過程中的重要組成部分，但這類研究的最終目標當然是在化學反應中實際利用酶進行生物催化。傳統(tǒng)上，大型不銹鋼反應器已用于生物催化反應；然而，小型化的連續(xù)流反應器現(xiàn)在允許用更小的體積進行實驗，從而顯著降低了成本。此外，在連續(xù)流反應器中，給定反應的參數(shù)可以更容易地管理，因為不需要機械混合，因此可以通過減少反應時間來加速反應。酶本身也可以在微反應器內(nèi)以及溶液內(nèi)使用（固定化）。

由于酶的生產(chǎn)通常是昂貴的，因此在誘導反應后高效和有效地回收酶通常是非常需要的。將酶固定在反應器內(nèi)或較大顆粒上是提高酶回收率的常用方法。此外，酶的穩(wěn)定性通?？梢酝ㄟ^誘導固定化來提高。然而，不適當?shù)拿腹潭赡軐е旅附Y(jié)構(gòu)的有害變化，從而降低酶活性。設計用于固定酶的微流控系統(tǒng)可分為三種類型：壁涂型、填充型和單片型。在壁涂層型微反應器中，將酶直接固定在通道壁上。盡管與傳統(tǒng)反應器相比，微流控系統(tǒng)中的表面與體積之比顯著更高，但壁尺寸（因此酶負載能力）保持相對較小，并且底物擴散路徑相對較長。為了緩解這些缺點，研究人員開發(fā)了額外的粘附結(jié)構(gòu)，如二氧化硅納米彈簧，以增加酶促粘附層（見圖3）?；蛘撸部梢詫⒍鄬用秆b載到通道壁上，從而增加所述酶的可用性。相反，填充型微反應器用帶有固定化酶的顆粒填充微流控通道。與壁涂微反應器相比，這使得酶負載能力大大提高，同時底物的擴散路徑相對較短。例如，Kundu等人在填充型反應器中使用市售的PMMA珠粒進行聚己內(nèi)酯的連續(xù)聚合，并觀察到與間歇式反應器相比聚合更快，分子質(zhì)量更高。單片式微反應器旨在通過用互連的多孔結(jié)構(gòu)填充通道來克服高壓和有限的流體流動和傳熱（在密集床型微流控通道中可見）的常見問題。

圖3 用納米彈簧基質(zhì)固定化酶微反應器以增加酶的可用性。

雖然使用微流控技術進行酶篩選在產(chǎn)量和速度上有革命性的提高，但微流控酶生物反應器需要證明其巨大的優(yōu)勢，才能與行業(yè)中使用的常見生物反應器裝置競爭。此外，需要克服這些小型化系統(tǒng)的傳感技術缺乏標準化和局限性，以實現(xiàn)酶生物過程的微流控設備。

3.檢測和分析

檢測一定環(huán)境中分子的存在是便攜式微流控系統(tǒng)的經(jīng)典應用。生物領域可以通過使用能夠?qū)Ω鞣N化合物進行生物傳感的細胞來幫助完成這類任務——例如，某些類型的微藻可以用于檢測除草劑、重金屬和揮發(fā)性有機化合物等污染物。在一個實驗中，以微藻萊茵衣藻為特征的微流控介電泳系統(tǒng)用于通過熒光檢測檢測汞、甲基汞、銅和銅納米顆粒。在另一個微流控系統(tǒng)中，部署了藻類熒光生物傳感器，通過使用集成到系統(tǒng)本身的發(fā)光二極管和光感受器來檢測除草劑Diuron的存在。這種方法并不局限于細胞；還可以使用酶、抗體作為生物傳感器識別元件。在環(huán)境分析、臨床診斷和食品樣品分析的背景下，這些替代生物成分已成功用于檢測微流控系統(tǒng)中的小分子、蛋白質(zhì)，甚至電解質(zhì)和氣體。

微流控系統(tǒng)中的細胞識別可以通過使用細胞的光學、電學和生物化學特性來實現(xiàn)，同時提供相對較快的結(jié)果（通常在采樣點）。這是海洋生物領域的一個特別關鍵的優(yōu)勢，因為海洋生物領域從水道和海洋中提取樣本。同樣，在食品生產(chǎn)中，快速識別細菌或真菌污染是確保食品安全的關鍵因素；同樣在生物領域中，細菌和真菌菌株的快速檢測和準確鑒定對于患者的早期診斷至關重要。

有幾種檢測方法已經(jīng)成功地適用于微流控裝置中。微藻可以使用光學特性進行檢測，例如光散射或熒光。電特性也已成功用于細胞識別。例如，Benazzi等人開發(fā)了一種微流控細胞儀，可用于基于使用兩個電極的阻抗測量和熒光測量來區(qū)分藻類細胞。該設備能夠檢測大于2μm的藻類細胞，并區(qū)分測試的三種不同藻類。阻抗測量也已被用于檢測食品樣品中的大腸桿菌污染，而無需樣品預富集或其他準備處理。

另一種細胞鑒定的方法是通過抗原檢測。通過使用特異性結(jié)合靶細胞的抗體，可以固定和檢測細胞。雖然這項技術廣泛用于妊娠測試的側(cè)流分析和快速新冠病毒檢測，但它也適用于微流控系統(tǒng)。這在醫(yī)學生物領域的子領域有著巨大的應用，可以提供快速診斷。例如，Pham等人已經(jīng)使用毛細管驅(qū)動的微流控系統(tǒng)來檢測瘧疾抗原，而不需要外部泵，并且其靈敏度水平適合于早期瘧疾檢測。

需要注意的是，傳統(tǒng)的PCR結(jié)果代表了檢測人群的平均值——換句話說，在更大的檢測人群中無法檢測到單個突變個體。然而，通過將樣品分布在油乳液中的許多微小水滴中，并僅在這些水滴內(nèi)部進行PCR反應，可以進行更詳細的方差分析。由于每個液滴中只包含一個細胞，因此每個PCR結(jié)果本質(zhì)上都是對一個細胞群體的分析。這種聚合酶鏈式反應方法被稱為數(shù)字聚合酶鏈式反應，液滴微流控的使用使聚合酶鏈式反應結(jié)果的吞吐量從幾百個顯著增加到數(shù)百萬個。Pekin等人使用皮升液滴微流控系統(tǒng)來識別癌基因的突變，其檢測靈敏度為200000個未突變基因中的一個突變。

雖然聚合酶鏈式反應可以用于識別細胞和檢測突變，但需要進行DNA測序才能真正識別樣本生物體內(nèi)的每個單個基因。測序方案對微流控的適應性提供了更高的吞吐量和并行化，如Aborn等人所證明的，其中Sanger方法的電泳步驟被并行化多達384個泳道。通過并行使用兩個微流控系統(tǒng)來加強清潔和裝載步驟，每天成功測序400萬個堿基。與單細胞培養(yǎng)類似，微流控技術也可用于單細胞測序，以深入了解群體中單個細胞的固有異質(zhì)性，并可用于癌癥和免疫疾病檢測。Lan等人利用液滴微流控系統(tǒng)進行單細胞測序，方法是生成條形碼液滴，將細菌封裝在單個液滴中，執(zhí)行純化步驟，然后將條形碼液滴和細菌液滴合并，將條形碼拼接到基因組片段上（見圖4）。

圖4 用于單細胞基因組測序的液滴微流控系統(tǒng)。a通過包封隨機DNA低聚物產(chǎn)生條形碼液滴并通過PCR擴增。b用熔融瓊脂糖包封細胞以產(chǎn)生微凝膠，每個微凝膠包含單個細胞。c通過一系列大量酶促和裂解步驟純化單細胞基因組。d將微凝膠重新封裝在含有標記（標記）試劑的液滴中。e將含有標記基因組的液滴依次與PCR試劑和條形碼液滴合并，然后進行PCR，將條形碼拼接到基因組片段上。

結(jié)論

微流控系統(tǒng)在所有生物領域子領域的細胞應用、酶應用和檢測分析應用中的實用性早已得到證明。由于其體積小，與傳統(tǒng)方法相比，這些微流控系統(tǒng)所需的化學物質(zhì)或樣品消耗要少得多，同時也為研究人員提供了對酶和細胞生理環(huán)境進行更精確反應控制的新機會。然而，到目前為止，應該注意的是，大多數(shù)微流控系統(tǒng)都是在生物領域開發(fā)的，盡管許多其他子領域也將受益于微流控系統(tǒng)的廣泛使用。在很大程度上，微流控系統(tǒng)仍處于實驗室階段，尚未實現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)應用。挑戰(zhàn)仍然存在于缺乏標準化和傳感器小型化，以及微流控系統(tǒng)與泵和分析設備的集成，以創(chuàng)建易于使用和可靠的設備。因此，迄今為止創(chuàng)建的大多數(shù)微流控系統(tǒng)都是圍繞成熟的應用開發(fā)的，以利用特定的優(yōu)勢。這通常涉及使用標準細胞系或來自生物領域子領域的分析。然而，這只是突顯了不同研究小組之間合作的日益重要，因為很明顯，微流控系統(tǒng)的好處應該以協(xié)同的方式擴展到所有生物領域子領域。