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有人說CCK8測細(xì)胞增殖這個實(shí)驗(yàn)唯一的難點(diǎn)是你得有CCK8這個試劑盒 那么這個有手就行的實(shí)驗(yàn)，為什么有時候還是做不好呢？ 從原理，步驟，注意事項(xiàng)和應(yīng)用，大家看我這一篇就夠了。 原理：CCK8是cell counting kit-8的簡寫，也就是細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒。CCK8可以用于細(xì)胞數(shù)測定、細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖/毒性檢測。優(yōu)點(diǎn)是靈敏、價格便宜、速度快、要求低（只要有酶標(biāo)儀就能測）。
圖1：WST-8和WST-8 formazan結(jié)構(gòu)（圖片來源于Abclonal CCK8試劑盒說明書） 原理：利用WST-8在電子耦合試劑存在的條件下，可以被線粒體里的脫氫酶還原產(chǎn)生棕黃色的formazan。然后就可以用OD450測吸光度了。OD450數(shù)值越大，顏色越深，說明細(xì)胞活性越強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量越多，或者細(xì)胞毒性越小。 CCK8法測定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的步驟（以Abclonal的試劑盒為例，小編一直用的挺好的）：
2. 加入10μL濃度梯度稀釋的要檢測的物質(zhì)（常見的就是測藥物的細(xì)胞毒性）。培養(yǎng)不同時間（藥物處理不同時間的毒性是不一樣的）。 3. 每個孔里面加10μL的CCK-8溶液。加的時候有2種方法。一是直接吸10μL加到每個孔里；二是配含有10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基，把96空板里的培養(yǎng)基棄掉，換成含有10%CCK-8的培養(yǎng)基。注意這里要做空白對照，就是單純培養(yǎng)基里（不鋪細(xì)胞）也要加10μL的CCK-8溶液。因?yàn)榕囵B(yǎng)基也能測出來OD450，所有實(shí)驗(yàn)組的OD值最后都要減掉這個對照組培養(yǎng)基的OD值的。 4. 孵育1-4小時，酶標(biāo)儀檢測OD450。 5. 數(shù)據(jù)處理：存活率（或者叫細(xì)胞活性之類的）=（實(shí)驗(yàn)組OD450-培養(yǎng)基OD450）/（對照組OD450-培養(yǎng)基OD450）x100% 注意事項(xiàng)： 1. 第一步鋪細(xì)胞的數(shù)量要具體問題具體分析了，有些細(xì)胞體積大就少鋪點(diǎn)，有些細(xì)胞體積小就多鋪點(diǎn)。鋪細(xì)胞前一定要混勻，或者鋪到孔里之后再晃勻。 2. 加CCK-8溶液的時候不能有氣泡，有氣泡可以用熱的針頭燙破。氣泡會影響OD值。 3. 孵育的時間要重點(diǎn)注意，最好先做個預(yù)實(shí)驗(yàn)。因?yàn)檎娴?span style="letter-spacing: 0.578px;font-size: var(--articleFontsize);color: rgb(255, 0, 0);">很容易o(hù)verload（數(shù)值超過4就overload了）然后拿不到數(shù)據(jù)。敷育時間一般不會超過2小時，期間可以觀察下液體顏色變化情況，不要等顏色很深了再去測。 4. 如果要測好幾個時間點(diǎn)的話，那每一組加完CCK8孵育的時間都要嚴(yán)格一致。因?yàn)榉跤臅r間越長，顏色越深，OD450也會越大。即便細(xì)胞活性低，孵育時間長了之后，也會和細(xì)胞活性高的組測出來一樣的數(shù)據(jù)。 5. 建議多做幾個重復(fù)，可以做5個重復(fù)。因?yàn)殡y免有些孔會翻車，數(shù)值偏離平均值太多，增加重復(fù)孔數(shù)量的話，即便有1-2個孔數(shù)值明顯不對，棄掉就可以了，這樣就不用重新做一遍。但凡看到此類試劑盒說明書讓你做3個重復(fù)的，水平你懂得。 6. 檢測某些開蓋后容易氧化的物質(zhì)，如果要測處理不同時間點(diǎn)的話，建議分成幾塊不同的板做。 7. 來不及測的話（大概率是別人長時間占用酶標(biāo)儀），可以加10μL 1%的SDS或者0.1 M HCL（加SDS比較方便，HCL是管控的取用還要登記啥的。）終止反應(yīng)。室溫放24小時吸光度都不會變。 |
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