FDX1參與了銅相關(guān)的細(xì)胞死亡方式——銅死亡，這可能會(huì)影響腫瘤進(jìn)展，如鐵死亡和焦亡。然而，F(xiàn)DX1在腫瘤中的作用仍需探索。本研究從泛癌癥的角度，基于綜合生物信息學(xué)，調(diào)查了FDX1的表達(dá)特征以及與預(yù)后、腫瘤分期、免疫微環(huán)境和銅死亡的相關(guān)性。

1. FDX1模式的表達(dá)及其在泛癌癥中的臨床特征

首先，為了研究FDX1在腫瘤和正常組織中的差異表達(dá)，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了FDX1的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）和胃腺癌（STAD）中，F(xiàn)DX1在腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織（圖1A）。而在乳腺浸潤(rùn)性癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、結(jié)腸腺癌（COAD）、腎嗜鉻細(xì)胞瘤（KICH）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）、前列腺腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）和甲狀腺癌（THCA）中，腫瘤組織中FDX1的表達(dá)水平降低（圖1A）。接下來(lái)，作者根據(jù)GTEx數(shù)據(jù)集分析了FDX1在正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，腎上腺、肝臟和甲狀腺中FDX1的表達(dá)水平較高，而血液、大腦和胰腺中的表達(dá)水平較低。然后，腫瘤細(xì)胞系中FDX1表達(dá)的結(jié)果顯示，根據(jù)CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)，它在腸道、胃、造血和淋巴組織中表達(dá)最高，在胸膜和上呼吸道中表達(dá)最低。

圖1 根據(jù)癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型組織表達(dá)（GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)，F(xiàn)DX1在人類(lèi)泛癌中的差異表達(dá)情況

由于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中正常樣本數(shù)量較少，作者進(jìn)一步整合了TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)評(píng)估FDX1的差異表達(dá)。如圖1B所示，F(xiàn)DX1在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和子宮內(nèi)膜腺癌（CESC）、結(jié)直腸腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、腎上腺皮質(zhì)腫瘤（KICH）、急性髓系白血?。↙AML）、低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、卵巢漿液性囊腺癌（OV）、胰腺腺癌（PAAD）、前列腺癌（PRAD）、皮膚切除性黑素瘤（SKCM）、胃腺癌（STAD）、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（TGCT）、甲狀腺癌（THCA）和子宮肉瘤（UCS）中上調(diào)，在膽管細(xì)胞癌（CHOL）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎盂細(xì)胞癌（KIRP）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）和直腸癌（READ）中下調(diào)。在腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）和子宮體內(nèi)膜癌（UCEC）中，F(xiàn)DX1的表達(dá)沒(méi)有差異（圖1B）。

此外，作者根據(jù)GEPIA2.0在不同癌癥階段探索了FDX1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)DX1在甲狀腺癌（F值=11，Pr(>F)=5.15e-07）、肝細(xì)胞癌（F值=6.11，Pr(>F)=0.000467）、腎透明細(xì)胞癌（F值=5.7，Pr(>F)=0.000759）、胰腺導(dǎo)管腺癌（F值=4.96，p=0.00253）、直腸癌（F值=4，Pr(>F)=0.0105）、腎盂癌（F值=3.34，Pr(>F)=0.0199）、食管鱗狀細(xì)胞癌（F值=3.26，Pr(>F)=0.023）和腎上腺皮質(zhì)癌（F值=2.81，Pr(>F)=0.0469）中表達(dá)差異顯著（圖2）。其他腫瘤階段，如腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌等，F(xiàn)DX1的表達(dá)沒(méi)有差異。

圖2 FDX1表達(dá)與腫瘤分期之間的相關(guān)性

采用單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型來(lái)探索FDX1的生存預(yù)測(cè)價(jià)值。通過(guò)OS、DSS和PFI評(píng)估FDX1的預(yù)后價(jià)值。OS結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤（GBMLGG）中，F(xiàn)DX1的表達(dá)是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素（HR = 4.17，p = 1.7e-19），在低級(jí)膠質(zhì)瘤（LGG）中也是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素（HR = 2.92，p = 9.5e-6），而在腎透明細(xì)胞癌（KIRC）和全腎癌隊(duì)列（KIPAN）中是一個(gè)保護(hù)因素（HR = 0.48，p = 1.3e-8；HR = 0.59，p = 8.1e-8）（圖3A）。DSS結(jié)果表明，在GBMLGG（HR = 4.64，p = 2.0e-20）、LGG（HR = 2.97，p = 1.5e-5）、黑色素瘤（SKCM）（HR = 1.72，p = 0.04）、KIRC（HR = 0.38，p = 6.1e-10）、KIPAN（HR = 0.50，p = 7.6e-9）、KIRP（HR = 0.56，p = 0.03）和胸腺瘤（THYM）（HR = 0.33，p = 0.03）中，F(xiàn)DX1與DSS相關(guān)。PFI的分析結(jié)果也表明，在腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）中，F(xiàn)DX1也是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素（HR = 1.34，p = 4.2e-3），而在甲狀腺癌（THCA）（HR = 0.46，p = 1.6e-3）和間皮瘤（MESO）（HR = 0.54，p = 0.03）中是一個(gè)保護(hù)因素。然后，Kaplan-Meier曲線顯示，F(xiàn)DX1的高表達(dá)與GBMLGG（HR = 3.45，p = 4.4e-18）和LGG（HR = 2.48，p = 8.1e-7）的不良預(yù)后相關(guān)，與KIPAN（HR = 0.4，p = 1.67e-7）和KIRC（HR = 0.45，p = 1.1e-7)（圖3B-E）。同時(shí)，作者分析了FDX1的表達(dá)與GBM、KICH和KIRP的預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，F(xiàn)DX1的高表達(dá)與GBM（HR = 1.4，p = 0.11）和KICH（HR = 3.53，p = 0.05）的不良預(yù)后相關(guān)，與KIRP（HR = 0.54，p = 0.04）的良好預(yù)后相關(guān)?？傊?，這些結(jié)果明顯反映了FDX1的高表達(dá)是LGG的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)也是KIRC的保護(hù)因素，影響了GBMLGG和KIPAN的預(yù)后。

圖3 根據(jù)TCGA泛癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)FDX1在不同癌癥類(lèi)型中的總體生存（OS）進(jìn)行分析

2. FDX1表達(dá)與泛癌免疫特征之間的相關(guān)性

為了探索銅死亡是否與腫瘤免疫微環(huán)境有關(guān)，作者研究了銅死亡核心蛋白FDX1與免疫的相關(guān)性。首先，作者使用TIMER算法（Li等，2017）探索了FDX1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。在多種癌癥中，特別是在LGG中，F(xiàn)DX1表達(dá)與B細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖4A）。除了CD4 T細(xì)胞外，F(xiàn)DX1還與PRAD、KIRC中的其他免疫細(xì)胞呈正相關(guān)（圖4A）。另外，在STAD中，F(xiàn)DX1表達(dá)與CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖4A）?；贓STIMATE分析，進(jìn)一步研究了FDX1表達(dá)與腫瘤環(huán)境之間的相關(guān)性（Yoshihara等，2013）。在LGG和GBMLGG中觀察到FDX1表達(dá)與StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore之間強(qiáng)烈的正相關(guān)（圖4B-D），而在KIRC和KIPAN中觀察到負(fù)相關(guān)（圖4B-D）。然而，在GBM中沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

圖4 FDX1與泛癌癥中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、LGGGBM、LGG、KIPAN和KIRC中的基質(zhì)得分、免疫得分和ESTIMATEScore之間存在相關(guān)性

免疫檢查點(diǎn)、腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)、同源重組缺陷（HRD）、TMB、MSI、DNMT和MMR是免疫治療和輔助治療的重要評(píng)估標(biāo)志，可以預(yù)測(cè)治療效果和患者的預(yù)后（Chiappinelli等，2016年；Luchini等，2019年；Clara等，2020年；Morand等，2021年）。因此，作者確定了FDX1表達(dá)與這些標(biāo)志之間的相關(guān)性。在LGG、TGCT和UVM中，F(xiàn)DX1表達(dá)與大多數(shù)免疫檢查點(diǎn)呈正相關(guān)，而在THCA和THYM中與大多數(shù)免疫檢查點(diǎn)呈負(fù)相關(guān)（圖5A）。具體而言，在LGG中，CD276（B7-H3）、CD274（PD-L1）、PDCD1LG2（PD-L2）、CTLA4、HAVCR2和PDCD1（PD-1）與FDX1強(qiáng)相關(guān)（圖5A）。此外，腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)相關(guān)分析表明，F(xiàn)DX1表達(dá)與多種腫瘤類(lèi)型的干細(xì)胞性質(zhì)評(píng)分相關(guān)（圖5B）。值得注意的是，在GBMLGG和LGG中觀察到強(qiáng)正相關(guān)，而在GBM中沒(méi)有觀察到顯著相關(guān)（圖5B）。HRD相關(guān)分析顯示，F(xiàn)DX1表達(dá)與14種腫瘤類(lèi)型的HRD顯著相關(guān)（圖5C）。類(lèi)似地，在GBMLGG（p = 0.00005，R = 0.16）和LGG（P = p = 2.30e-7，R = 0.23）中觀察到了強(qiáng)烈的正相關(guān)性，而在GBM中沒(méi)有觀察到顯著的相關(guān)性（圖5C）。同時(shí)，在KIPAN（p = 7.85e-7，R = -0.19）和KIRC（p = 0.0005，R = -0.16）中觀察到了強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)性（圖5C）。

圖5 FDX1表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)、DNA甲基化數(shù)據(jù)得出的干細(xì)胞程度評(píng)分以及同源重組缺陷（HRD）之間的關(guān)系

此外，作者的結(jié)果顯示，F(xiàn)DX1與TMB、MSI、DNMT和MMR在多種腫瘤類(lèi)型中密切相關(guān)。在TMB的分析過(guò)程中，結(jié)果顯示FDX1與ESCA、HNSC、LGG、LUSC、STAD和UCEC中的TMB呈正相關(guān)，與KIRC、LUAD、THYM和THCA中的TMB呈負(fù)相關(guān)（圖6A）。在DLBC、HNSC、KIRC、STAD和UCEC中觀察到FDX1表達(dá)與MSI呈正相關(guān)（圖6B）。而在LUAD、LUSC、PAAD和SKCM中，F(xiàn)DX1與MSI呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6B）。作者研究了基于MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EpCAM等五個(gè)基因的FDX1表達(dá)與MMR的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，F(xiàn)DX1表達(dá)與ACC、BLCA、CESC、COAD、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LUSC、OV、PRAD、READ、THCA、UCEC和UVM中的MMR密切相關(guān)（圖6C）。作者還研究了FDX1與DNA甲基化的關(guān)系，后者對(duì)于表觀遺傳學(xué)至關(guān)重要。作者分析了FDX1與包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B在內(nèi)的四種甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系。結(jié)果表明，在THYM、UCEC、UVM和LGG中，F(xiàn)DX1與DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B呈正相關(guān)（圖6D）。除了DNMT2之外，F(xiàn)DX1與GBM中的其他甲基化轉(zhuǎn)移酶呈負(fù)相關(guān)（圖6D）。

圖6 FDX1與腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、錯(cuò)配修復(fù)（MMR）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）之間的相關(guān)性

3. 驗(yàn)證FDX1表達(dá)及其與腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤相關(guān)的腫瘤特征

根據(jù)以上結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)FDX1表達(dá)與預(yù)后、免疫浸潤(rùn)以及免疫治療相關(guān)因素（包括免疫檢查點(diǎn)、腫瘤干細(xì)胞性質(zhì)、HRD、TMB、MMR和DNMT）在低級(jí)膠質(zhì)瘤中具有顯著相關(guān)性。因此，作者進(jìn)一步根據(jù)中國(guó)低級(jí)膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（CGGA）驗(yàn)證了FDX1在低級(jí)膠質(zhì)瘤中的促腫瘤作用。針對(duì)臨床特征，作者發(fā)現(xiàn)WHO II級(jí)、WHO III級(jí)和WHO IV級(jí)（p = 0.001）中FDX1表達(dá)存在顯著差異，且FDX1在WHO IV級(jí)（GBM）中高表達(dá)，相比于WHO II級(jí)、III級(jí)（LGG）（圖7A），與TCGA-GBM和TCGA-LGG的結(jié)果一致（圖1A、B）。異染色酸脫氫酶（IDH）突變狀態(tài)和1p/19q共缺失狀態(tài)是評(píng)估膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)后和治療情況的重要因素。作者發(fā)現(xiàn)FDX1在IDH野生型患者中高表達(dá)（p = 0.0052），在1p/19q非共缺失患者中高表達(dá)（p = 3.6e-09）（圖7B、C）。隨后，作者還說(shuō)明了FDX1在不同的膠質(zhì)瘤分子亞型中表達(dá)差異，包括LGG IDH突變-1p/19q編碼型、LGG IDH突變-1p/19q非編碼型、LGG IDH突變-野生型和GBM IDH突變、IDH野生型（p = 4.6e-05）（圖7D），表明FDX1在膠質(zhì)瘤分子亞型中表達(dá)差異，并提示FDX1在膠質(zhì)瘤的預(yù)后和治療中可能具有潛在功能。

圖7 根據(jù)中國(guó)腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（CGGA），F(xiàn)DX1在腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）中的差異表達(dá)情況

然后，生存分析顯示FDX1的高表達(dá)是原發(fā)性膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)）和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)）的不良預(yù)后因素（p < 0.0001和p = 0.034）（圖8A）。在不同分級(jí)中，作者的結(jié)果表明FDX1的高表達(dá)是WHO II級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤（低級(jí)膠質(zhì)瘤）的風(fēng)險(xiǎn)因素（p = 0.018）（圖8B），這個(gè)結(jié)果與TCGA-LGG的結(jié)果相似（圖3C）。然而，在WHO III級(jí)（低級(jí)膠質(zhì)瘤）（p = 0.28）、WHO IV級(jí)原發(fā)性膠質(zhì)瘤（高級(jí)膠質(zhì)瘤）（p = 0.51）、WHO II級(jí)（低級(jí)膠質(zhì)瘤）（p = 0.33）、WHO III級(jí)（低級(jí)膠質(zhì)瘤）（p = 0.16）和WHO IV級(jí)（高級(jí)膠質(zhì)瘤）復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤（p = 0.18）中，這個(gè)結(jié)果并未得到證實(shí)（圖8B-D）。這些結(jié)果驗(yàn)證了TCGA中的生存分析結(jié)果。

圖8 基于CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)的FDX1表達(dá)在膠質(zhì)瘤中的總生存(OS)分析

為了闡明FDX1對(duì)LGG存活的具體機(jī)制，GSEA分析根據(jù)TCGA-LGG和CGGA-LGG（WHO II、III級(jí)）中的高低亞組，提出了FDX1的關(guān)鍵生物功能。生物過(guò)程結(jié)果表明，高FDX1表達(dá)亞組主要涉及免疫介導(dǎo)途徑，包括正調(diào)節(jié)髓樣白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、巨噬細(xì)胞趨化、內(nèi)源性抗原的抗原處理和呈遞，以及炎癥反應(yīng)，例如正調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)通路和基于TCGA-LGG和CGGA-LGG數(shù)據(jù)集的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)（圖9A、B）。同時(shí)，KEGG途徑顯示高FDX1表達(dá)亞組參與了免疫介導(dǎo)途徑，包括白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移和B細(xì)胞受體，與炎癥相關(guān)的途徑，包括Nod樣受體信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路，以及與代謝相關(guān)的途徑，如花生四烯酸代謝（圖9C、D）。隨后，對(duì)Hallmark途徑的分析有助于研究與腫瘤相關(guān)的途徑。作者的研究結(jié)果表明，F(xiàn)DX1基因組的高表達(dá)主要與活性氧（ROS）途徑、TGF-β信號(hào)通路和蛋白質(zhì)分泌有關(guān)。根據(jù)TCGA-LGG和CGGA-LGG數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)（圖9E，F(xiàn)），低FDX表達(dá)與KRAS信號(hào)通路有關(guān)。值得注意的是，這些結(jié)果反映了FDX1的生物功能涉及免疫介導(dǎo)的途徑、炎癥、代謝和細(xì)胞死亡相關(guān)的途徑。

圖9 FDX1基因的生物功能在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)集中顯示在LGG的生物過(guò)程（BP）途徑、KEGG途徑和Hallmark途徑中

作者進(jìn)一步驗(yàn)證了CGGA數(shù)據(jù)集中FDX1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，在CGGA-LGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，F(xiàn)DX1與ESTIMATEScore（R = 0.39，p = 4.9e-8）、ImmuneScore（R = 0.39，p = 6.2e-8）和StromalScore（R = 0.37，p = 2.3e-7）呈正相關(guān)（圖10A），與TCGA-LGG的結(jié)果一致（圖4B-D）。在CGGA-GBM數(shù)據(jù)庫(kù)中，F(xiàn)DX1與ESTIMATEScore（R = 0.16，p = 0.06）、ImmuneScore（R = 0.15，p = 0.07）和StromalScore（R = 0.16，p = 0.06）之間沒(méi)有差異（圖10B），與TCGA-GBM的結(jié)果一致。然后，相關(guān)分析顯示，在TCGA-LGG（圖10C）和CGGA-LGG數(shù)據(jù)集（圖10D）中，F(xiàn)DX1表達(dá)與DC、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞和B細(xì)胞呈正相關(guān)。此外，在CGGA-LGG數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)DX1表達(dá)與許多免疫檢查點(diǎn)呈正相關(guān)，其中CD274、CD276、HAVCR2、ICOS和PDCD1LG2與FDX1表達(dá)在TCGA-LGG和CGGA-LGG數(shù)據(jù)集中均呈正相關(guān)。

圖10 基于TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)以及CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore，F(xiàn)DX1與LGG中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)

4. FDX1與其他與銅死亡相關(guān)基因之間的相關(guān)性

作者采用相關(guān)性分析來(lái)闡明FDX1與銅死亡相關(guān)基因之間的關(guān)系。作者的結(jié)果表明，在TCGA-LGG數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)DX1表達(dá)與銅死亡抑制基因ATP7B呈負(fù)相關(guān)，與銅死亡促進(jìn)基因SLC31A1呈正相關(guān)，與銅死亡必需基因二硫輔酶S-乙酰轉(zhuǎn)移酶(DLAT)、二硫輔酶脫氫酶(DLD)、硫輔酶合酶(LIAS)、脂肪酰轉(zhuǎn)移酶1(LIPT1)呈正相關(guān)（圖11A）。在CGGA-LGG數(shù)據(jù)集中，作者觀察到FDX1表達(dá)與SLC31A1、DLAT、DLD和LIPT1之間存在類(lèi)似的正相關(guān)關(guān)系（圖11B）。但是，F(xiàn)DX1表達(dá)與ATP7B和LIAS之間沒(méi)有差異。

圖11 FDX1表達(dá)與銅死亡相關(guān)基因之間的相關(guān)性

總結(jié)

在作者的研究中，作者探討了FDX1在TCGA人類(lèi)泛癌中的作用，包括臨床和免疫學(xué)特征。特別地，作者發(fā)現(xiàn)FDX1是一個(gè)預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子，并與CGGA的免疫微環(huán)境相關(guān)。FDX1與免疫治療預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，包括免疫檢查點(diǎn)、腫瘤干細(xì)胞、HRD和TMB，有密切關(guān)聯(lián)，這表明它可能作為免疫治療預(yù)測(cè)因子的潛在作用?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的研究應(yīng)用了泛癌生物信息學(xué)分析，并發(fā)現(xiàn)FDX1可能被視為L(zhǎng)GG中潛在的預(yù)后不良生物標(biāo)志物和免疫治療預(yù)測(cè)因子。但以上所有結(jié)果仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。